VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
4.2.2 Biosensor đo quang
Nguyên tắc của nó là dựa vào mối quan hệ giữa lượng OP bị thủy phân với lượng sản phẩm mang màu hình thành từ phản ứng enzyme. Sản phẩm mang màu có thể được định lượng bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng λmax của nó.
Hình 4. 4: Sơ đồ cấu tạo biosensor OPH trên sợi quang
Cấu tạo biosensor gồm: đèn hồ quang xenon 75W (b) phát ra từ nguồn một chiều cung cấp điện thế cố định (a) với bộ phận lọc ánh sáng đơn sắc (c) gắn ở một nhánh của sợi quang, dùng để lọc ánh sáng ở bước sóng xác định (400 nm đối với pnitrophenol – sản phẩm thủy phân của paraoxon và parathion; 348 nm đối với chlorferon – sản phẩm thủy phân từ coumaphos), sợi quang hình chữ Y (d) và bộ phận lọc ánh sáng đơn sắc thứ 2 (e) gắn ở đầu còn lại của sợi quang với bước sóng đặt giống như (c); bộ phận dò quang (f) và recoder (g).
OPH được cố định lên màng nylon bằng liên kết ngang với glutaraldehyde và boine serum albumin lên đầu sợi quang với khoảng cách 0,8 mm.
Điều kiện thí nghiệm tối ưu: pH 9,0, 30oC và 123 IU OPH cố định. Với điều kiện này biosensor có thể detect ít nhất 2µM paraoxon, parathion và 5µM coumaphos mà không bị nhiễu bởi carbamate và triazine; thời gian phân tích khoảng 2 phút. [38]
Biosensor này không phụ thuộc vào sự thay đổi pH nên có thể sử dụng dung dịch đệm với lực ion cao (do trong phép đo pH, độ nhạy của phép đo tỷ lệ nghịch với lực ion
của dung dịch đệm). Nhờ đó, enzyme có thể hoạt động với hoạt tính cao nhất trong suốt quá trình phân tích.
4.2.3. Biosensor đo cường độ dòng điện
Nguyên tắc: quá trình thủy phân OP như parathion, methyl parathion, paraoxon và fenitrothion sinh ra p – nitrophenol (PNP). PNP có thể bị oxy hóa điện hóa ở anode theo phản ứng sau:
Khi đặt điện thế cố định lên điện cực làm việc (0.85 V so với Ag/AgCl) sẽ sinh ra dòng điện tỷ lệ với nồng độ PNP hình thành.
Cấu tạo biosensor:
Gồm enzyme OPH trong màng Nafion cố định trên điện cực làm việc screen-print. Các thông số tối ưu:
Hàm lượng OPH là 1080 IU, giới hạn phát hiện là 7 x 10-8 M methyl parathion, thấp hơn so với 2 – 5 x 10-6 M của biosensor OPH – đo điện thế và đo quang.
Rất nhiều ứng dụng của biosensor phân tích thuốc trừ sâu trong môi trường được báo cáo nhưng chỉ có rất ít ứng dụng trong thực phẩm. Mặc dù rất cần phân tích nhanh chóng những chất khác nhau trong thực phẩm nhưng biosensor thâm nhập vào lĩnh vực này khá chậm. [38]
PHẦN 5
ỨNG DỤNG BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH
THUỐC KHÁNG SINH (ANTIBIOTIC) TRONG THỰC PHẨM
Người ta sử dụng thuốc kháng sinh để chống lại các loài vi khuẩn nhiễm trong gia súc, cừu, heo, và gia cầm. Nó còn được sử dụng để bảo vệ cây ăn quả. Dư lượng của thuốc kháng sinh đối với người tiêu dùng nó là chất độc, chất gây dị ứng, và tăng khả năng kháng thuốc của vi khuẩn. Hơn nữa, trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm từ sữa, sữa bị nhiễm kháng sinh có thể làm ức chế canh trường vi sinh dùng trong sản xuất yogurt và phô mai, làm giảm tính kinh tế.
Rất nhiều phương pháp phân tích chất kháng sinh ra đời: sắc kí lỏng cao áp (HPLC), sắc kí khí – quang phổ khối lượng (GC-MS), và sắc kí lỏng – quang phổ khối lượng (LC-MS), phương pháp ức chế vi khuẩn truyền thống, phương pháp thí nghiệm miễn dịch (immunoassay). Tuy nhiên, những phương pháp đó cần thời gian dài, điều này không tốt khi kiểm soát chất lượng thực phẩm (đặc biệt là sữa), ngoài ra còn sử dụng những dụng cụ cồng kềnh phức tạp và đòi hỏi người có chuyên môn cao [39]
Biosensor chủ yếu sử dụng trong phân tích kháng sinh là biosensor sử dụng nguyên tắc cộng hưởng plasmon bề mặt (surface plasmon resonance – SPR).
5.1 Phân tích dư lượng β-lactam trong sữa
Nhóm β-lactam là một trong những nhóm kháng sinh quan trọng nhất, được dùng trong thuốc thú y để trị các bệnh nhiễm trùng máu, nước tiểu và phổi, đặc biệt hơn là bệnh viêm vú ở bò sữa. Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm nguồn gốc động vật (sữa, thịt) có thể gây ra những hậu quả: ảnh hưởng không mong muốn của vi sinh vật trong công nghiệp sản xuất từ sữa, dị ứng cho người tiêu dùng,… Giới hạn dư lượng lớn nhất (maximum residuce limit – MRL) là 4µg/l đối với penicillin G, penethamate, amoxicillin và ampicillin; 30µg/l đối với cloxacillin, oxacillin, dicloxacillin và nafcillin trong sữa [40]
Bảng 5. 1: Cấu trúc và dư lượng lớn nhất cho phép có trong thực phẩm của β-lactam (theo tiêu chuẩn của Hội đồng Châu Âu)
-lactam R R’ Giới hạn dư lượng lớn nhất
(MRL) (g/kg) Penicillin G 4 Amoxilcillin 4 Ampicillin 4 Cloxacillin 30 Oxacillin 30 Cefalexin 100 Cephapirin 60 Ceftiofur 100
Biacore là một loại biosensor SPR được sử dụng nhiều nhất để phát hiện dư lượng β-lactam trong sữa. Biacore thường sử dụng kháng thể làm bioreceptor, có độ nhạy và độ chọn lọc cao. Do độ chọn lọc cao nên phổ phát hiện thường bị giới hạn, bởi mức độ xảy ra phản ứng chéo trong cùng 1 nhóm rất thấp. Guadin và cộng sự (2001) đã mô tả phương pháp Biacore để phân tích penicillin trong sữa bằng kháng thể đơn dòng kháng ampicillin, nhưng kháng thể này có ái lực mạnh với β-lactam dạng không hoạt động (vòng hở) hơn là β-lactam dạng hoạt động, vì thế, trước khi tiến hành phân tích phải thủy phân β-lactam bằng phương pháp enzyme (penicillinase) hay phương pháp hóa học; giới hạn phát hiện của hai phương pháp thủy phân lần lượt là 12,5; 33 µg/kg (tính theo ampicillin). Giá trị này lớn hơn nhiều so với giới hạn dư lượng lớn nhất đặt ra (MRL), đó là do phương pháp kháng thể phát hiện cả β-lactam hoạt động và không hoạt động nhưng giá trị MRL được thiết lập trên hợp chất còn hoạt động nên việc phát hiện dạng không hoạt động không quan trọng. Nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng tìm cách làm giảm tính đặc hiệu của kháng thể nhưng đều không đạt kết quả mong muốn. Tuy nhiên, có một giải pháp mới khá khả thi là sử dụng thụ thể protein (receptor protein) làm bioreceptor thay vì dùng kháng thể. Những thụ thể này thường tìm thấy ở màng tế bào vi khuẩn, thường được chia thành
những chất có hoạt tính carboxypeptidase, transpeptidase, và transglycosylase. Trong bài này chủ yếu sử dụng thụ thể protein có hoạt tính carboxypeptidase.
Cơ chất của enzyme DD-carboxypeptidase từ Streptomyces R39 thường là những peptide tận cùng bằng D-alanyl-D-alanine. Penicilin có cấu trúc tương tự dipeptide D- Ala-D-Ala nên enzyme cũng tác dụng vào cấu trúc β-lactam. Khi β-lactam liên kết với carboxypeptidase sẽ hình thành nên phức chất rất bền: R39-benzylpenicillin (thời gian bán hủy là 68 h) ở 37oC, do đó hoạt tính enzyme bị ức chế. Đây là phản ứng ức chế thuận nghịch, khi enzyme ra khỏi phức chất nó vẫn giữ hoạt tính ban đầu trong khi β-lactam chuyển hóa thành phenylacetylglycine và N–formyl-D-penicillamine [41].
Hình 5. 1: Phản ứng chuyển hóa penicillin G (a) thành phenylacetylglycine (b) và N–formyl-D-penicillamine (c)
Enzyme R39 thủy phân 3-peptide thành 2-peptide như phản ứng sau: L-Lys-D-Ala-D-Ala + H2O L-Lys-D-Ala + D-Ala
Phản ứng này bị ức chế khi có mặt penicillin vì liên kết amide trong vòng β-lactam có cấu trúc tương tự với cơ chất bình thường. Phản ứng giữa enzyme với kháng sinh tạo ra chất trung gian acyl-enzyme bền và quá trình thủy phân 3-peptide sẽ bị ức chế.
Biacore gồm có sensor chip CM5 (hình), chủ yếu hoạt động theo nguyên tắc cộng hưởng bề mặt plasmon (SPR), trên bề mặt cảm biến có gắn 2-pepdide bằng phương pháp của Johnsson và cộng sự (1995).
Nguyên tắc hoạt động (theo tài liệu [40][41]):
Mẫu sữa được trộn với 3-peptide và R39 để được hỗn hợp. Hỗn hợp được “ủ” ở 47oC trong 5 phút. Trong suốt quá trình “ủ”, R39 thủy phân 3-peptide thành 2-peptide. Khi có mặt β-lactam, phản ứng xúc tác bị ức chế và 2-peptide tạo ra ít hơn. Sau khi “ủ”, kháng thể 2-peptide được thêm vào mẫu, hỗn hợp được inject vào bề mặt cảm biến (có 2- peptide cố định). Với mẫu không có β-lactam, kháng thể bị ức chế bởi 2-peptide (hình thành trong mẫu). Nếu mẫu có chứa β-lactam, kháng thể sẽ liên kết với 2-peptide cố định trên bề mặt của cảm biến. Do nguyên tắc phát hiện trong Biacore là dựa trên sự thay đổi chỉ số khúc xạ (phụ thuộc vào khối lượng) ở bề mặt cảm biến. Lượng kháng thể 2-peptide
liên kết với bề mặt sẽ được đo. Tín hiệu nhận được tỷ lệ trực tiếp với lượng penicillin G trong mẫu sữa. Toàn bộ quá trình mất khoảng 9 phút.
Để kiểm tra tính đặc hiệu của R39, mẫu sữa có chứa penicillin G (nồng độ 4 và 8 µg/kg) đươc xử lý bằng β-lactamase để thủy phân cấu trúc β-lactam. Với những mẫu này, cùng với mẫu không xử lý enzyme, được phân tích bằng nguyên tắc 2-peptide như trên. Kết quả cho thấy thể phát hiện dư lượng kháng sinh trong mẫu có xử lý β-lactamase, trong khi tín hiệu lại cho ở mẫu không xử lý là 4,0 và 7,7 µg/kg. Do đó, β-lactam bị thủy phân không ức chế enzyme R39 (Gaudin và cộng sự, 2001).
Bảng 5. 2: Thông số tối ưu của phương pháp 2 – peptide
Thông số Trường hợp 1 Trường hợp 2
Vận tốc dòng (l/phút) 10 30
Nồng độ R39 a (g/ml) 4,9 4,6
Tỷ lệ mẫub và kháng thể (%) 88:12 10:90
Nồng độ kháng thể tiêm vào (g/ml) 80 31
Tỷ lệ sữa tiêm vào (%) 70 8
Dung dịch tái sinh NaOH + SDS c NaOH + AcN d
a: Trước khi R39 trộn với mẫu và 3-peptide b: Mẫu = sữa + R39 + 3-peptide
c: 40 mM NaOH + 20 mM SDS
d: 0.5 M NaOH + 10% acetonitrile (AcN) SDS – Sodium dodecyl sulphate
AcN – Acetonitrile
Giới hạn phân tích ở trường hợp 1 là 2,5 µg/kg và ở trường hợp 2 là 1,2 µg/kg. Đối với trường hợp 2, lượng mẫu ít hơn, tốc độ dòng cao hơn nên phân tích được nhiều mẫu hơn trong cùng một thời gian. Đối với dung dịch tái sinh, NaOH + SDS tạo ra tín hiệu baseline cao hơn, không ổn định bằng SDS + AcN.
Một phương pháp khác tương tự: sau khi ủ ở 47oC trong 30 phút, mẫu được trộn với kháng thể kháng 3-peptide và hỗn hợp được tiêm qua bề mặt cảm biến cố định sẵn 3- peptide. Nếu mẫu có chứa β-lactam, kháng thể kháng 3-peptide sẽ gắn với 3-peptide chưa bị thủy phân trong mẫu. Ngược lại, nó sẽ gắn với 3-peptide trên bề mặt. Tín hiệu đầu ra tỷ lệ nghịch với nồng độ β-lactam trong mẫu.
Hình 5. 2: Nguyên tắc của phương pháp 2-peptide và 3-peptide
Bảng 5. 3: Giới hạn dò tìm (LOD) và độ chính xác (CV) của phương pháp 2-peptide và 3- peptide khi thử nghiệm trong mẫu sữa có chứa 4 µg/kg penicillin G trong sữa
Độ chính xác giữa các mẫu (n = 10) Độ chính xác giữa các ngày (n = 3) Thí nghiệm Giới hạn dò tìm (µg/kg) Giá trị (µg/kg) CV (%) Giá trị (µg/kg) CV (%) 2 – peptide 1,2 4,3 3,1 4,1 2,2 3 – peptide 1,5 3,7 4,8 3,7 1,8
Phương pháp 3-peptide có khả năng nhận ra sự khác biệt giữa các mẫu có nồng độ penicillin G khác nhau nên nó có độ nhạy cao hơn. Cả 2 phương pháp trên được ứng dụng để phát hiện hàm lượng kháng sinh β-lactam trong mẫu sữa do nó có LOD (2.5µg/kg) thấp hơn MRL quy định bởi EU (4µg/kg – đối với penicillin G).