VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
3.3 Biosensor điện hóa
Biosensor điện hóa là thiết bị phân tích theo dõi sự thay đổi về các thông số điện hóa như cường độ dòng điện, điện thế hay trở kháng. Nó có ưu điểm hơn so với biosensor quang là có thể hoạt động trong môi trường dày đặc (turbid media), ít tốn chi phí hơn, nhỏ gọn, có thể được gắn trong hệ thống FIA để phát hiện chất cần phân tích một cách liên tục.
Campylobacter là loài quan trọng nhất gây ra bệnh tiêu chảy cấp tính cho người trên toàn thế giới, trong đó đáng chú ý nhất là C.jejuni và C.coli. D. Ivniski và cộng sự (2000) đã nghiên cứu việc dùng màng kép lipid hai chiều để phát hiện nhanh vi khuẩn gây bệnh, cụ thể là Campylobacter [35].
Màng lipid kép là môi trường tự nhiên để giữ các hợp chất như protein, cơ quan thụ cảm, màng, mô và thậm chí cả tế bào nguyên mà không bị biến tính. Màng lipid kép có thể là chất cách điện mỏng, là nơi để xảy ra tương tác kháng thể - kháng nguyên, là điện cực lưỡng cực cho phản ứng oxy hóa khử, là nơi xảy ra phản ứng chuyển hóa năng lượng. Hơn nữa, màng lipid kép sau khi biến đổi cũng có thể trở thành một transducer để chuyển hóa tín hiệu, và những chức năng khác nữa được nghiên cứu trong tài liệu [35]. Trong những năm gần đây, đã có nhiều nỗ lực để gia tăng sự bền cơ của màng lipid kép bằng cách gắn nó lên chất mang rắn, khi đó nó có thể giữ được nhiều hợp chất khác nhau như peptide, enzyme, kháng thể, cơ quan thụ cảm, chất mang ion và chất oxy hóa khử, lần lượt phát hiện được cơ chất, kháng nguyên, hormon, ion, và chất nhận hay chất cho điện tử. Các hợp chất đó khi được gắn vào màng lipid kép sẽ trở thành những cái “kênh”(channel). Khi kênh mở, ion đi qua màng do sự chênh lệch điện thế hay nồng độ ion ở hai bên của màng. Nguyên lý này đã dẫn đến sự ra đời của biosensor kênh ion (ion – channel). Nguyên tắc hoạt động của biosensor là kiểm soát dòng điện ion xuyên màng khi chất cần phân tích tương tác với những hợp chất được giữ trên màng (đóng vai trò là bioreceptor của biosensor). Có thể phát hiện kênh đang mở hay đóng một cách trực tiếp thông qua độ dẫn điện của màng, hay sự thay đổi nồng độ ion tức thời. Bằng cách thay đổi loại biorecptor trong màng lipid kép trên bề mặt điện cực, ta có thể thay đổi độ chọn lọc của màng giữa chất này với chất kia.
Để phát hiện trực tiếp Campylobacter bằng biosensor kênh ion, người ta sử dụng kháng thể kháng Campylobacter nhốt trong màng lipid kép làm bioreceptor và tiến hành đo cường độ dòng điện trong tế bào điện hóa. Ngâm dây thép không gỉ vào dung dịch phosphatidylcholine trong squalene 1:1 v/v trong vòng 5 – 10 phút để tạo màng lipid kép trên đầu điện cực, sau đó đem ngâm tiếp vào dung dịch chứa kháng thể Campylobacter
trong 5h để kháng thể được giữ trong màng lipid. Tất cả các phép đo được tiến hành trong tế bào điện hóa (V = 0,3 ml) chứa sẵn dung dịch đệm acetate (pH 5,6), KCl và CaCl2, điện cực làm việc là điện cực có phủ màng lipid, điện cực đếm carbon và điện cực so sánh Ag/AgCl. Đặt điện thế vào điện cực làm việc là – 0,1V so với Ag/AgCl, và đo cường độ dòng điện sinh ra, ta sẽ suy ra được nồng độ vi sinh vật có trong mẫu.
Hình 3. 9: Tế bào điện hóa
Kháng thể kháng vi khuẩn khi được gắn trong màng sẽ trở thành protein kênh (channel-forming protein). Lỗ kênh kháng thể được hình thành từ 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ (như hình…b). Khi vi khuẩn có mặt trong mẫu, nó sẽ tương tác với kháng thể trong màng lipid, làm thay đổi hình dạng của phân tử kháng thể, điều này gây cản trở khả năng thấm ion của màng, do đó ion được vận chuyển qua kênh và đo được cường độ dòng điện.
Hình 3. 10: (a) Cấu trúc biosensor kênh ion; (b) Kênh ion trong màng lipid kép được hình thành từ phân tử kháng thể.
Hình 3. 11: Kết quả đáp ứng của biosensor kênh ion khi phân tích Campylobacter. (a) Điện cực chỉ phủ màng lipid kép; (b) và (c) điện cực phủ màng lipid có kháng thể.
Hình (a) do màng lipid kép không cho thấm được phân tử phân cực hay ion nên không có tín hiệu cường độ dòng điện đầu ra. Mỗi xung xuất hiện ứng với thời điểm vi sinh vật tương tác với kháng thể. Nồng độ vi sinh vật càng cao thì sẽ càng có nhiều xung xuất hiện. Dựa vào độ lớn xung, số Avogadro và hằng số Faraday, ta tính được nồng độ ion đi qua kênh trong 1 đơn vị thời gian, từ đó suy ra được nồng độ vi khuẩn.
Biosensor này có độ chọn lọc cao, thời gian phân tích ngắn (khoảng 10 phút), được áp dụng để xác định vi khuẩn Campylobacter trong nước uống, thực phẩm mà không cần “làm giàu” mẫu trước thí nghiệm.
Liu Yang (2001) cũng đã giới thiệu biosensor điện hóa hai enzyme (tyrosinase và horseradish peroxidase) để phát hiện nhanh Salmonella Typhimurium trong mẫu thực phẩm [31]. Phương pháp phân tích bằng biosensor này gồm 3 bước. Bước đầu tiên là cho phản ứng miễn dịch và quá trình tách từ xảy ra. Trong bước này, người ta trộn hỗn hợp gồm những hạt từ có phủ kháng thể kháng Salmonella (ASCMB) và phức kháng thể kháng Salmonella – enzyme alkaline phosphate (APLAS) vào mẫu chứa Salmonella. Hỗn hợp được trộn đều ở 37oC trong 1 h để hình thành phức dạng kẹp (sandwich) ASCMB –
Salmonella – APLAS. Sau đó phức dạng kẹp được tách ra khỏi dung dịch bằng từ trưòng mạnh trong 2 phút, đem ly tâm và rửa bằng 0,1% casein (hòa tan trong dung dịch đệm phosphate pH 7,4) để loại bỏ những liên kết không đặc hiệu giữa hạt từ phủ kháng thể và phức kháng thể - enzyme hay những protein khác. Bước thứ hai là phản ứng enzyme xảy ra để tạo phenol. Phức dạng kẹp được hòa tan trong dung dịch 0,7 ml 25 mM tris-
(hydroxymethyl)-aminomethane) (pH 10,0) chứa 0,1 ml 10mM disodium phenyl phosphate, MgCl2 được cho vào để hoạt hóa enzyme (khoảng 0,1 m 10 mg/ml). Enzyme alkaline phosphatase sẽ thủy phân cơ chất phenyl phosphate thành phenol. Phenol sinh ra tỷ lệ tương ứng với lượng enzyme, lượng enzyme lại phụ thuộc vào số lượng vi khuẩn. Do đó, bằng cách định lượng nồng độ phenol tạo ra ta có thể biết số vi khuẩn trong mẫu (bước thứ ba). Ta có thể định lượng phenol bằng phương pháp điện hóa – đo cường độ dòng điện với điện cực carbon gắn trong hệ thống FIA (tốc độ dòng là 0,5 ml/phút). Hai enzyme tyrosinase và horsradish peroxidase (HRP) được cố định lên điện cực carbon bằng liên kết ngang với glutaradehyde và bovine serum albumin. Tyroxidase xúc tác phản ứng oxy hóa phenol thành o-quinone khi có mặt oxy. O-quinone bị khử thành catechol ở điện cực làm việc khi đặt điện thế - 0,2V (so với điện cực so sánh Ag/AgCl) làm sinh ra dòng điện tỷ lệ với lượng phenol. Tyrosinase còn có tác dụng tái sinh cơ chất catechol thành o-quinone, làm tăng tín hiệu đầu ra. Nhưng Conier và cộng sự (1996) lại đề nghị sử dụng enzyme HPR đồng cố định với tyrosinase để tăng độ nhạy của phép đo, vì enzyme HPR có tính đặc hiệu với hợp chất phenol cao hơn, và khả năng tái sinh o-quinone cao hơn tyrosinase. Ngoài ra, khi hoạt động, enzyme HPR còn cần thêm cơ chất H2O2 – chất được xem là chất hoạt hóa enzyme tyrosinase (nếu với nồng độ 100 µM) (R. Soln´a, 2005).
Hình 3. 12: Cơ chế khuếch đại của điện cực cặp enzyme để phát hiện phenol với sự có mặt của H2O2
Biosensor được thí nghiệm trên mẫu thịt bò xay để phát hiện S.typhimurium. Kết quả phương trình tuyến tính giữa cường độ dòng điện đo được và số lượng vi khuẩn có trong mẫu là: log(Ir) = 0,2589lg(N) – 0,8895 với R2 = 0,96 với giới hạn phát hiện là 2,8 x 103 cfu/ml, thời gian phân tích cho mỗi mẫu là 2h.
PHẦN 4
ỨNG DỤNG BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH THUỐC TRỪ
SÂU TRONG THỰC PHẨM
Từ cuối chiến tranh thế giới lần thứ 2, để gia tăng sản lượng rau quả và thịt gia súc, hóa chất được sử dụng rất nhiều để hạn chế sâu bệnh. Việc sử dụng thuốc trừ sâu cần phải kiểm soát chặt chẽ vì nó có thể gây ô nhiễm môi trường và làm hại sức khỏe con người trực tiếp hay thông qua thức ăn.
Hiện nay có hơn 500 hợp chất trên thế giới là thuốc trừ sâu hay sản phẩm trao đổi chất của thuốc trừ sâu. Organophosphate và carbamate là hai nhóm thuốc trừ sâu được sử dụng rộng rãi nhất trong nông nghiệp. Nó là chất độc thần kinh do có khả năng ức chế enzyme acetycholinesterase một cách không thuận nghịch, làm tích tụ acetylcholine, gây tác hại đến phản ứng cơ của cơ thể và những cơ quan khác, nếu bị nặng hơn có thể dẫn đến tử vong.
Một số phương pháp đang được sử dụng để xác định và kiểm soát hàm lượng thuốc trừ sâu là: sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký bản mỏng và nhiều phương pháp quang phổ khác (Aprea và cộng sự, 2002). Những phương pháp này khá tốn kém, mất nhiều thời gian, chuẩn bị mẫu phức tạp và không thể dùng trong phân tích liên tục được. Biosensor là phương pháp hữu hiệu để phát hiện thuốc trừ sâu một cách nhanh chóng và được nghiên cứu trong nhiều năm qua.