VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
4.1Phương pháp ức chế enzyme
Do organophosphate và carbamate đều có hoạt tính ức chế enzyme cholinesterase (acetyl- hay butyl-cholinesterase) nên ta có thể dựa vào độ giảm hoạt tính của enzyme mà biết được nồng độ của chất cần phân tích.
Cấu tạo biosensor:
Gồm: màng enzyme cholinesterase (ChE) gắn với các loại transducer khác nhau như:
- Transducer đo cường độ dòng điện: đo nồng độ H2O2 sinh ra (tỉ lệ với nồng độ thiocholine sinh ra từ phản ứng thủy phân cơ chất do enzyme AChE) từ đó suy ra được nồng độ thuốc trừ sâu. (Palchetti và cộng sự, 1997; Diehl-Faxon và cộng sự, 1996; La Rosa và cộng sự, 1994; Martorell và cộng sự, 1994; Skladal, 1991; Marty và cộng sự, 1992; Palleschi và cộng sự, 1992; Skladal and Mascini, 1992; Mionetto và cộng sự, 1994; Trojanowicz và Hitchman, 1996).
- Transuder đo điện thế: đo độ thay đổi pH theo nồng độ acid acetic sinh ra (Kumaran và Tranh-Minh, 1992; Tran-Minh và cộng sự, 1990; Chuna Bastos và cộng sự, 1991; Kumaran và Morita, 1995; Dzyadevich và cộng sự, 1994).
- Transducer đo quang (thông qua sợi quang học): kiểm soát sự thay đổi pH khi sử dụng chất phát huỳnh quang gắn với AChE (Rogers và cộng sự, 1991; Hobel and Polster, 1992; Garcia de Maria và cộng sự, 1994; Moris và cộng sự, 1995).
Sau đây sẽ giới thiệu về biosensor đo cường độ dòng điện.
Biosensor đo cường độ dòng điện:
Nguyên tắc: cho biosensor tiếp xúc với dung dịch đệm có chứa cơ chất (thường là acetylthiocholine) để cho ra thiocholine và acid acetic, khi có mặt thuốc trừ sâu thì enzyme sẽ bị giảm hoạt tính do đó tạo ra thiocholine ít hơn. Bằng cách đo nồng độ thiocholine trước và sau khi biosensor tiếp xúc với dung dịch mẫu (chứa thuốc trừ sâu), sẽ suy ra được nồng độ thuốc trừ sâu.
Cấu tạo biosensor gồm có màng enzyme AChE (acetylcholinesterase hay butylcholinesterase, tùy theo cơ chất sử dụng là acetylthiocholine hay butylthiocholine) cố định trên điện cực carbon screen-print.
Phản ứng xảy ra như sau:
Thiocholine sau đó sẽ bị oxy hóa điện hóa bằng cách đặt điện thế cố định lên điện cực làm việc (thường khoảng 0,7 V so với Ag/AgC). Trong quá trình oxy hóa thiocholine sẽ sinh ra dòng điện. Bằng cách đo dòng điện trước và sau khi xảy ra ức chế, ta có thể tính được phần trăm ức chế, từ đó suy ra được nồng độ thuốc trừ sâu.
Trong quá trình tạo điện cực carbon, ta thêm vào cobalt phthalocynanine (CoPC). Nhờ CoPC làm xúc tác mà quá trình oxy hóa điện hóa thiocholine có thể xảy ra với điện thế làm việc thấp (khoảng +100mV so với Ag/AgCl).
Hình 4. 1: Bề mặt cấu tạo của điện cực cobalt phthalocyanine (CoPC)
Biosensor dạng này có thể phát hiện được các loại thuốc trừ sâu khác nhau trong sản phẩm thực phẩm.
Biosensor để phát hiện carbamate trong các sản phẩm trồng trọt: [37] - Transducer có sử dụng CoPC, điện thế đặt vào là +350mV.
- Dung dịch đệm phosphate pH 7,0 - Thời gian ủ: 10 phút.
- Biosensor này có thể detect được nhóm N-methylcarbamates (aldicarb, carbaryl, carbofuran, methomyl và propoxur) trong khoai tây, cà rốt, tiêu ngọt. - Khoảng tuyến tính 5 x 10-5 – 50 mg/kg.
- Giới hạn phát hiện (khi phần trăm ức chế là 10%): 1 x 10-4 đến 3,5mg/kg (tùy enzyme AChE hay BChE và chất ức chế cụ thể).
Biosensor để phát hiện thuốc trừ sâu trong dung dịch như nước máy và nưóc ép trái cây:
- Điện thế đặt vào 0,7V
- Dung dịch đệm (0.1M phosphate buffer and 0,1M KCl, pH 7,5). - Thời gian ủ: 12 phút
- Biosensor có thể phát hiện paraoxon và carbofuran với giới hạn phát hiện là 10-10-10 – 10-11 M
Do enzyme ChE bị thuốc trừ sâu ức chế không thuận nghịch nên biosensor dạng này chỉ sử dụng được một vài lần do hoạt tính của enzyme giảm dần theo thời gian; do đó người ta còn có thể thay thế enzyme ChE bằng enzyme acid phosphatase (AP) cố định lên
điện cực làm việc. AP sử dụng cơ chất là L-ascorbic acid 2-phosphate để thủy phân nó thành acid ascorbic. Phản ứng thủy phân bị ức chế (thuận nghịch) bởi organophosphate, nên nồng độ acid ascorbic tạo ra tỷ lệ nghịch với nồng độ thuốc trừ sâu có trong mẫu. Bằng cách đo nồng độ acid ascorbic thông qua biosensor đo cường độ dòng điện sử dụng điện cực screen-print, ta sẽ biết được nồng độ thuốc trừ sâu trong mẫu.
Các thông số của phương pháp này:
Điện thế cố định đặt lên điện cực làm việc là +400mV so với Ag/AgCl. Dung dịch đệm: citrate 0,1M, pH 5,5
Phương trình đường chuẩn: Y = I (nA); X = malathion (ppb): Y = 0,69 + 0,057X Khoảng tuyến tính (ppb): 10 – 100
Hệ số tương quan: 0,9908 Giới hạn dò tìm (ppb): 5