VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
4.2 Phương pháp sử dụng enzyme thủy phân
Phương pháp ức chế enzyme mặc dù có độ nhạy cao, nhưng cũng có một số nhược điểm như:
- ChE, acid phosphatase không chỉ bị ức chế bởi oraganophosphate mà còn bởi carbamate và một số chất khác trong mẫu, do đó nó không có tính chọn lọc cao, không thích hợp khi muốn phân tích hàm lượng một chất cụ thể thuốc trừ sâu.
- Phải thông qua nhiều bước đo như: đo tín hiệu trước và sau khi ức chế bởi thuốc trừ sâu, nên thời gian khá dài (khoảng hơn 10 – 15 phút)
- Khả năng tái sử dụng thấp. Nếu muốn tái sử dụng, phải thông qua bước hoạt hóa bằng dung dịch thích hợp, nhưng cũng không thể hoạt hóa về hoạt tính như ban đầu, và khó khăn nhất là khi quá trình ức chế đối với enzyme là không thuận nghịch.
Do đó, còn một phương pháp khác để khắc phục nhược điểm trên, đó là sử dụng enzyme organophosphorus hydrolase (OPH) thay cho enzyme AChE. [38]
Cấu tạo biosensor:
Gồm màng OPH phủ trên các transducer như:
- Transducer đo điện thế như điện cực pH hay ISFET.
- Transducer đo quang: kiểm soát sản phẩm mang màu như p-nitrophenol sinh ra khi thủy phân OP (paraoxon, parathion, methyl parathion); hay chlorferon sinh
- Transducer đo cường độ dòng điện.
OPH là enzyme lần đầu tiên được phân lập từ vi sinh vật đất Pseudomonas diminuta và Flavobacterium. Nó xúc tác phản ứng thủy phân nhiều loại OP như paraoxon, parathion, coumaphos, diazinon, dursban, methyl parathion,…
Hình 4. 2:Phản ứng xúc tác của organophosphate bởi OPH. X: oxy hay lưu huỳnh; R: gốc alkoxy (từ methoxy đến butoxy); R’: gốc alkoxy hay phenyl; Z: gốc phenoxy.
4.2.1 Biosensor đo điện thế
Cấu tạo biosensor: gồm màng OPH cố định lên điện cực pH qua liên kết ngang OPH với bovine serum albumin và glutaraldehyde.
Hình 4. 3: Sơ đồ cấu tạo biosensor OPH
Biosensor sẽ được tối ưu hóa về tín hiệu đáp ứng và thời gian đáp ứng: hàm lượng enzyme OPH là 500 IU, hoạt động ở pH 8,5, dung dịch đệm gồm 1m HEPES cùng với 100mM NaCl và 0,05 mM cobalt chloride ở 20oC. Hoạt động dưới điều kiện như thế, biosensor có thể phát hiện được ít nhất 2µM paraoxon, ethyl parathion, methyl parathion và diazinon với độ chính xác và độ chọn lọc cao (không bị những chất không phải OP gây nhiễu như simazine, triazine, atrazine, sevin và sutan) trong thời gian khoảng 2 phút.
Biosensor có độ bền ít nhất 1 tháng khi bảo quản ở pH 8,5; 1mM HEPES + 100 mM NaCl ở 4oC. Độ tương quan của nó với phương pháp quang phổ khá cao, khoảng 0,998. [38].