1.6.1. Cỏc biện phỏp khụng đặc hiệu .
Bệnh sởi cú thể cỏch ly tại nhà. Việc cỏch ly trong cộng đồng dõn cƣ rộng lớn là khụng thực tế. Ở bệnh viện, việc cỏch ly cần đƣợc tiến hành từ lỳc bắt đầu cú dấu hiệu viờm long cho đến 4 ngày sau phỏt ban, việc này cú ý nghĩa vừa phũng lõy nhiễm sang bệnh nhõn khỏc, vừa phũng bội nhiễm và biến chứng [1], [18]. Khụng cần tẩy uế buồng bệnh sau khi khỏi bệnh vỡ vi rỳt sởi rất yếu ở ngoại cảnh, chỉ cần làm thoỏng khớ buồng bệnh và lau chựi đồ đạc bằng khăn ẩm [1],[22].
1.6.2. Biện phỏp đặc hiệu
Biện phỏp đặc hiệu để phũng bệnh sởi là tiờm vắc xin sởi [1], [11]. Cú 3 loại vắc xin sởi:
Vắc xin sởi chết
Vắc xin sởi sống giảm độc lực [72].
Vắc xin sởi dạng phối hợp (MMR, Rouvax, Rimevax, Trimovax):
Đõy là một loại vắc xin tốt chỉ cần tiờm một mũi phũng đƣợc 3 bệnh là sởi, quai bị và Rubella. Thực chất đõy cũng là dạng vắc xin sởi sống giảm độc lực phối hợp với 2 loại vắc xin sống khỏc là quai bị và Rubella [5], [7].
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. Đối tƣợng và địa điểm nghiờn cứu.
2.1.1. Đối tượng.
- Bệnh nhõn cú sốt phỏt ban nghi sởi trong cộng đồng ở tỉnh Nghệ An từ thỏng 1 năm 2009 đến thỏng 6 năm 2011.
2.1.2. Địa điểm và cỏch bảo quản mẫu.
+ Cỏc mẫu mỏu của bệnh nhõn đƣợc lấy và vận chuyển về khoa xột nghiệm Trung tõm Y tế dự phũng tỉnh, chắt huyết thanh và bảo quản ở - 200C trƣớc khi gửi ra Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng.
+ Mẫu dịch ngoỏy họng: Giữ ở 40C và chuyển ngay ra viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng trong cựng ngày hoặc ngày hụm sau.
+ Địa điểm xột nghiệm ELISA, Phõn lập vi rỳt và giải trỡnh tự gen:
Phũng thớ nghiệm vi rỳt sởi Viện vệ sinh Dịch tễ trung ƣơng.
2.1.3. Tiờu chuẩn xỏc định ca bệnh.
Tất cả cỏc bệnh nhõn sốt phỏt ban đƣợc đỏnh giỏ nghi là bệnh sởi dựa trờn cơ sở tiờu chuẩn dấu hiệu lõm sàng của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) nhƣ sau:
+ Sốt cao + Ban đỏ
+ Cú it nhất một trong cỏc triệu chứng sau: ho, sổ mũi hoặc viờm kết mạc mắt.
2.1.4. Tiờu chuẩn loại trừ.
+ Bệnh nhõn khụng hợp tỏc lấy mẫu.
+ Cỏc mẫu mỏu lấy khụng đủ tiờu chuẩn (tan huyết, số lƣợng dƣới 0,5 ml)
2.2. Thời gian nghiờn cứu
Từ thỏng 1 năm 2009 đến thỏng 6 năm 2011.
2.3. Vật liệu nghiờn cứu
2.3.1. Bệnh phẩm
- Huyết thanh: 475 mẫu mỏu đƣợc ly tõm và chắt lấy ớt nhất 1ml huyết thanh, bảo quản ở - 200C (tại khoa xột nghiệm TTYTDP tỉnh Nghệ An) đến khi gửi ra Viện VSDTTW làm xột nghiệm.
- Dịch ngoỏy họng: 30 mẫu dịch ngoỏy họng đƣợc lấy từ cỏc bệnh nhõn sốt phỏt ban trong 3 ngày đầu của bệnh.
2.3.2. Sinh phẩm và hoỏ chất
2.3.2.1. Mụi trường vận chuyển bệnh phẩm dịch họng
- Mụi trƣờng vận chuyển bệnh phẩm (VTM) Thành phần Số lƣợng Đỏ phenol 0,4% 2 ml Hepes 1M 20 ml Bovine Albumin 20% 10ml Peniciline/Streptomycine 10 ml DMEM x10 100 ml Nƣớc cất vừa đủ 1000ml NaHCO3 4,4% Điều chỉnh pH = 6,7
2.3.2.2. Bộ kit ELISA
Behring Enzygnost anti Measles IgM- hóng Dade Behring/Đức. TCYTTG cung cấp: Xỏc định khỏng thể IgM khỏng Sởi.
2.3.2.3. Mụi trường nuụi cấy tế bào.
- Dulbecco‟s modified Eagle medium (DMEM) x1. Hóng Gibco - Khỏng sinh Peniciline/Streptomycine. Hóng Sigma
- Trypsin- EDTA: Hóng Sigma
- Huyết thanh bờ bào thai. Hóng Gibco
Thành phần mụi trƣờng nuụi tế bào và phõn lập vi rỳt
TT Thành phần MT nuụi TB MT phõn
lập VR
1 D-MEM (Without NaHCO3 and L-Glu) 83.5 ml 90.3 ml
2 L-glutamine 200 mM 1.0 ml 1.0 ml
3 Fetal calf serum 10.0 ml 2.0 ml
4 NaHCO3 solution 7.5% 3.5 ml 4.5 ml
5 HEPES 1M 1.0 ml 1.0 ml
6 Penicillin/strept. Solution 1.0 ml 1.0 ml
7 0.4% phenol red 0.2 ml 0.2 ml.
TT 100 ml 100 ml
2.3.2.4. Hoỏ chất cho kỹ thuật sinh học phõn tử
- Bộ tỏch chiết ARN. Hóng QIAgen
- Bộ sinh phẩm RT- PCR. Hóng Invitrogen - Mồi xuụi và mồi ngƣợc: Hóng Invitrogen
* MV 63: 5‟CTGGCCCTCGGCCTCTCGCAC1709 - Sinh phẩm làm sequencing:
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit; hóng ABI
Kit tinh sạch sản phẩm sequencing: DyeEx 2.0 Spin Kit, hóng Quigen
2.3.3 Tế bào
Dũng tế bào Vero/SLAM. TCYTTG cung cấp để phõn lập vi rỳt sởi
2.3.4. Trang thiết bị
- Mẫu phiếu điều tra
- Tube, bơm kim tiờm lấy mỏu - Que ngoỏy họng
- Phớch đỏ và bỡnh tớch lạnh - Pipet, đầu cụn, tube
- Mỏy rửa ELISA - Mỏy đọc ELISA - Slide làm phản ứng - Buồng ủ giữ ẩm
- Kớnh hiển vi huỳnh quang - Chai nuụi cấy tế bào 25-75 cm2 - Tủ lạnh 4-80C
- Kớnh hiển vi quang học lộn ngƣợc - Mỏy chạy PCR
- Mỏy lắc - Mỏy trộn mẫu - Lũ vi súng - Bộ chạy điện di - Mỏy chụp gel - Mỏy sequencer - Tủ ấm.
2.4. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
2.4.1. Thiết kế nghiờn cứu
Nghiờn cứu mụ tả cắt ngang.
2.4.2. Cỡ mẫu
Theo cụng thức tớnh của nghiờn cứu mụ tả nhƣ sau:
Trong đú:
n: Cỡ mẫu tối thiểu
p: Tỷ lệ bệnh nhõn bị mắc sởi trờn tổng số bệnh nhõn sốt phỏt ban nghi sởi, ở đõy chỳng tụi lấy p = 0,45 theo nghiờn cứu của Viờn Quang Mai (Tại tỉnh Quảng Trị năm 2002)
: khoảng sai lệch mong muốn giữa tỷ lệ bệnh thu đƣợc từ mẫu và tỷ lệ thực của quần thể. Chỳng tụi lấy = 0,05
: Mức ý nghĩa thống kờ, chỳng tụi lấy =0,05
1- /2 : giỏ trị Z thu đƣợc tƣơng ứng với giỏ trị đƣợc chọn. Với mức = 0,05 đó chọn ở trờn ta cú 1- /2 =1,96
n = Z2 1-α/2
p(1-p) ∆2
Vậy cỡ mẫu của nghiờn cứu đƣợc tớnh là: n = 1,962 x 0,45x 0,55 = 380 0,052
- Thực tế mẫu của nghiờn cứu này là 475 trƣờng hợp.
2.5. Kỹ thuật thu thập thụng tin
2.5.1. Phỏng vấn trực tiếp
- Theo mẫu phiếu điều tra bệnh nhõn nghi sởi đƣợc thiết kế dựa vào mục tiờu của nghiờn cứu và mẫu phiếu điều tra trƣờng hợp nghi mắc sởi của BYT.
2.5.2. Lấy mẫu bệnh phẩm: Theo tiờu chuẩn của TCYTTG.
* Mẫu huyết thanh do cỏn bộ xột nghiệm TTYTDP huyện và tỉnh Nghệ An lấy.
Mẫu dịch ngoỏy họng do nghiờn cứu viờn thực hiện.
* Huyết thanh: mỏu đƣợc lấy từ ngày thứ 4 sau phỏt ban, lấy 3ml- 5ml mỏu tĩnh mạch, ly tõm chắt 1- 1,5ml huyết thanh và bảo quản ở - 200
C cho đến khi làm xột nghiệm.
* Dịch ngoỏy họng miệng: đƣợc lấy sau khi phỏt ban càng sớm cỏng tốt, tốt nhất là trong vũng ba ngày đầu, nếu khụng cú thể trong vũng 7 ngày đầu.
- Bệnh nhõn hỏ miệng
- Dựng đố lƣỡi đố lƣỡi xuống
- Dựng tăm bụng miết mạnh khu vực 2 amidan và vỏch phớa sau vũm hầu họng, trỏnh chạm vào lƣỡi
Cho tăm bụng vào tube đựng mẫu cú mụi trƣờng vận chuyển và bảo quản lạnh 40C rồi vận chuyển ngay đến phũng thớ nghiệm (PTN) trong vũng 48 giờ.
2.6. Phƣơng phỏp, kỹ thuật xột nghiệm chẩn đoỏn bệnh sởi.
2.6.1. Kỹ thuật ELISA
Kỹ thuật này nhằm xỏc định hiệu giỏ khỏng thể IgM khỏngvi rỳt sởi : Theo thƣờng quy của bộ kớt Behring Enzygnost anti Measles Vi rỳt IgM.
Sơ đồ 2.1: phản ứng ELISA xỏc định khỏng thể IgM/Sởi
Kỹ thuật tiến hành:
Hồi chỉnh RF absorbent: thờm 5ml nƣớc cất vào mỗi lọ. Đỏnh dấu cỏc tube làm phản ứng: P/N, P/P, M1,M2,P/P. Cho 400 l sample buffer vào mỗi tube P/N và P/P.
Thờm 20 l chứng chuẩn P/N, P/P vào mỗi tube tƣơng ứng. Trộn đều. Nhỏ 10 l mẫu vào mỗi tube đƣợc đỏnh dấu. Trộn đều nhẹ nhàng. Nhỏ 210 l RF absorbent vào mỗi tube mẫu tƣơng ứng. Trộn kỹ. ủ ở nhiệt độ phũng trong 15 phỳt (hấp phụ IgG trong huyết thanh).
Ủ 370C trong 60 phỳt trong tỳi kớn.
Chuẩn bị cộng hợp: Pha 250 l cộng hợp với 12,5 ml đệm và lắc trộn nhẹ nhàng. Chuẩn bị pha dung dịch rửa: 20ml dung dịch rửa POD + 400 ml nƣớc cất.
Rửa tấm 4 lần bằng dung dịch rửa đó pha loóng. Đập nhẹ tấm loại bỏ dịch thừa.
Nhỏ 100 l cộng hợp POD/ khỏng IgM của ngƣời vào mỗi giếng. Bọc kớn, ủ 370
C trong 60 phỳt.
Chuẩn bị dung dịch cơ chất: 1ml Chromogen TMB trộn với 10ml đệm cơ chất TMB. Rửa 2 lần.
Nhỏ 100 l dung dịch cơ chất Chromogen vào mỗi giếng. Bọc tấm trong tỳi kớn. ủ tối 30 phỳt ở nhiệt độ phũng.
Nhỏ 100 l chất dừng phản ứng vào cỏc giếng
Đọc kết quả bằng mỏy đọc ở bƣớc súng 450 và 650 nm trong vũng một giờ.
Phõn tớch kết quả:
A= OD đo đƣợc ở giếng mẫu cú khỏng nguyờn - OD đo đƣợc ở giếng chứng khỏng nguyờn
- Tiờu chuẩn phản ứng:
A của chứng P/P chuẩn phải nằm trong giới hạn cho phộp (theo bảng giỏ trị barcode). Độ chờnh lệch giữa cỏc giỏ trị P/P trong cựng một dóy giỏ trị của tấm khụng khỏc biệt nhau quỏ 20%.
A của chứng P/P chuẩn ≥0,2 A của chứng P/N chuẩn ≤ 0,1
- Kết quả phản ứng:
+ Kết quả õm tớnh với khỏng thể IgM khỏng sởi nếu A < 0,100. + Kết quả dƣơng tớnh với khỏng thể IgM khỏng sởi nếu A > 0,200. + Kết quả nghi ngờ nếu 0,100 < A < 0,200.
2.6.2 Kỹ thuật phõn lập vi rỳt.
- Bệnh phẩm sau khi lấy đƣợc bảo quản và vận chuyển ngay tới phũng xột nghiệm vi rỳt sởi viện Vệ sinh Dịch tễ trung ƣơng trong vũng 48h để tiến hành nuụi cấy và phõn lập theo cỏc bƣớc sau:
Xử lý bệnh phẩm
Xử lý bệnh phẩm với khỏng sinh: mụi trƣờng xử lý bệnh phẩm cú 200u/ml penicillin và 200u/ml streptomycin. Trộn kỹ trờn mỏy lắc để cỏc chất dớnh vào tăm bụng đƣợc hoà tan vào mụi trƣờng, loại bỏ tăm bụng.
Ủ 1 giờ ở nhiệt độ phũng.
Cỏc bƣớc nuụi cấy phõn lập.
Nuụi cấy tế bào Vero/ SLAM trờn chai 25cm2
, chọn chai tế bào một lớp cú độ phỏt triển kớn khoảng 80%
Đổ mụi trƣờng phỏt triển và thay bằng mụi trƣờng duy trỡ D- MEM 2% huyết thanh bờ bào thai để phõn lập vi rỳt.
Gõy nhiễm 0,5-1ml bệnh phẩm vào chai tế bào. Ủ tế bào tại 370
C
Theo dừi tế bào hàng ngày phỏt hiện sự huỷ hoại tế bào dƣới kớnh hiển vi lộn ngƣợc.
Sau 4-5 ngày gõy nhiễm, nếu tế bào khụng hủy hoại thỡ cấy chuyển bằng cỏch trypsin hoỏ tỷ lệ 1:3
Nếu cấy chuyển lần 2 sau 4-5 ngày vẫn khụng cú hủy hoại thỡ cú thể cấy chuyển thờm một lần nữa theo tỷ lệ 1:3. Sau 3 lần cấy chuyển nếu khụng cú huỷ hoại tế bào thỡ kết quả là õm tớnh.
Khi cú huỷ hoại tế bào khoảng 75% thỡ gặt tế bào và giữ ở -700
C để xỏc định chủng vi rỳt sởi cũng nhƣ phõn tớch vật liệu di truyền để xỏc định kiểu gien của vi rỳt.
Phƣơng phỏp gặt tế bào để giữ chủng vi rỳt
Nạo tế bào khỏi thành chai vào mụi trƣờng.
Hỳt hết mụi trƣờng và tế bào vào tube ly tõm và ly tõm 1500 vũng/ 1 phỳt. Loại bỏ dịch nổi và hoà cặn tế bào vào 1ml D-MEM-PS. Chia ra hai tube và cất ở -700C.
2.6.3 Kỹ thuật tỏch chiết ARN và phản ứng RT- PCR/Seq.
* Tỏch chiết ARN: theo bộ kit QIAamp Viral ARN Mini kit của hóng QIAgen
Cỏc bƣớc tiến hành
Bứơc 1: Trộn 140 l mẫu vào 560 l đệm AV trong tube ly tõm, ủ ở nhiệt độ phũng 10 phỳt.
Bƣớc 2: Thờm 560 l ethanol trộn trong 15 giõy.
Bƣớc 3: Thờm 630 l dung dịch trờn vào cột ly tõm QIAamp đặt trong tube ly tõm 2ml, ly tõm 8000 vũng/ phỳt, loại bỏ tube ly tõm.
Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc 3.
Bƣớc 5: Thờm 500 l đệm AW1 vào cột ly tõm, ly tõm 8000 vũng/1phỳt
Bƣớc 6: Thờm 500 l đệm AW2 vào cột ly tõm, ly tõm 14000 vũng/ 1 phỳt, loại bỏ tube ly tõm.
Bƣớc 7: Thờm 60 l đệm AVE ủ 2 phỳt ở nhiệt độ phũng, ly tõm 8000 vũng/ 1 phỳt . Phần dịch thu đƣợc chứa ARN.
* Phản ứng RT-PCR + Nƣớc đó khử ion 75 l + Reaction mix 2x 12,5 l + Tap polymerase 1 l + Mồi xuụi 0.5 l + Mồi ngƣợc 0,5 l + ARN 3,0 l Tổng cộng: 25,0 l
Cho cỏc mẫu vào mỏy PCR với chu kỳ nhiệt nhƣ sau: + 01 chu kỳ 450C/ 30‟ : tổng hợp cDNA
+ 01 Chu kỳ 940C/5‟: Triệt tiờu toàn bộ ARN cũn lại + Chu kỳ:
940C/15‟‟: Biến tớnh 580C/30‟‟: Gắn mồi 680C: Kộo dài
+ 01 chu kỳ: 680C/5‟: kộo dài + Giữ ở 40
C
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trờn gel agarose 2% với hiệu điện thế 100V trong khoảng 30 phỳt, nhuộm ethidium bromide trong 5 phỳt rồi rửa bằng nƣớc cất. Sau khi nhuộm, vạch ADN sẽ phỏt sỏng dƣới đốn cực tớm.
2.6.4 Xỏc định trỡnh tự đoạn gien N bằng phương phỏp sequencing
2.6.4.1.Tinh sạch sản phẩm PCR.
A. Quy trỡnh tinh sạch sản phẩm PCR: Sản phẩm ARN sau khi
đƣợc tổng hợp sẽ đƣợc tinh khiết bằng bộ kit Wizard SV gel and PCR clean up System (Promega) theo quy trỡnh của nhà sản xuất:
(1) Thờm 50 l dung dịch Membrade Binding Solution vào týp chứa sản phẩm PCR ( 50 l)
(2) Đặt cột lọc (SV Minicolumn) vào týp 2ml sạch
(3) Hỳt hỗn hợp dịch Membrade Binding Solution và sản phẩm PCR vào cộc lọc, ủ tại nhiệt độ phũng trong vũng 1 phỳt.
(4) Tiến hành ly tõm ở 14.000 rpm/1 phỳt, chuyển cột lọc ra ngoài và loại bỏ dịch lọc trong týp, đặt cột lọc trở lại týp.
(5) Rửa cột lọc bằng cỏch thờm 700 l dung dịch rửa Membrane Wash Solution, ly tõm ở 14.000 rpm/1 phỳt, loại bỏ dịch lọc trong týp và đặt cột lọc trở lại týp. Tiến hành rửa lần 2, thờm 500 l dung dịch rửa Membrane Wash Solution, ly tõm ở 14000 rpm/5 phỳt.
(6) Chuyển cột lọc ra khỏi mỏy ly tõm, cẩn thận trỏnh làm ƣớt đỏy cột với dịch lọc bờn dƣới týp. Loại bỏ dịch lọc, đặt cột lọc trở lại và tiến hành ly tõm trong 1 phỳt với nắp mở để bay hơi nốt lƣợng ethanol cũn dƣ.
(7) Cẩn thận chuyển cột lọc sang týp 1.5ml sạch. Thờm 50 l nƣớc (Nuclease – free Water) trực tiếp vào giữa cột, trỏnh chạm đầu cụn vào màng lọc. Ủ tại nhiệt độ phũng trong vũng 1 phỳt. Ly tõm ở 14.000 vũng/1 phỳt
(8) Loại bỏ cột lọc và thu giữ sản phẩm tinh sạch PCR ( 50 l) trong týp 1.5ml. Lƣu giữ sản phẩm tinh sạch PCR tại 40C hoặc – 200C.
B. Quy trỡnh tổng hợp sản phẩm PCR - sequencing: Phản ứng
PCR – Sequencing đƣợc thực hiện với bộ kit BigDye Terminator 3.1 Cycle sequencing kit (Applied Biosystems)
Tổng hợp sản phẩm PCR - sequencing: tổng thể tớch 20 l của dung dịch bao gồm 2 l BigDye Terminator, 4 l đệm 5X Sequencing, 3.2 pM primer, 10-40 ng sản phẩm tinh sạch PCR. Trộn đều dung dịch và chạy chƣơng trỡnh Sequencing trờn mỏy PCR theo chu kỳ PCR/Sequencing
960C trong vũng 1 phỳt 25 chu kỳ tại 960
C trong 10 giõy, 500C trong 20 giõy, 600C trong 4 phỳt.
C. Quy trỡnh tinh sạch sản phẩm PCR - sequencing: Sản phẩm
PCR – Sequencing sau khi tổng hợp đƣợc tiến hành tinh sạch bằng bộ kit DyeEx 2.0 spin collum Qiagen theo cỏc bƣớc sau:
(1) Vortex nhẹ nhàng cột tinh sạch
(2) Nới lỏng nắp cột, điều này là cần thiết để trỏnh khoảng khụng bờn trong cột lọc
(3) Bẻ góy nắp đúng dƣới đỏy cột, và đặt cột lọc vào týp 2 ml (cú sẵn trong bộ kit)
(4) Ly tõm ở 750g/ 3 phỳt
(5) Cẩn thận chuyển cột lọc sang týp ly tõm sạch. Nhỏ chậm sản phẩm PCR – Sequencing (10 – 20 l) lờn bề mặt của màng cột lọc
Chỳ ý: Nhỏ sản phẩm trực tiếp vào giữa bề mặt màng cột lọc. Khụng đƣợc để sản phẩm hoặc đầu cụn chạm lờn thành cột lọc. Sản phẩm đƣợc nhỏ
từ từ thành giọt để hấp thu lờn bề mặt màng cột lọc và khụng chảy sang bờn