* Tỏch chiết ARN: theo bộ kit QIAamp Viral ARN Mini kit của hóng QIAgen
Cỏc bƣớc tiến hành
Bứơc 1: Trộn 140 l mẫu vào 560 l đệm AV trong tube ly tõm, ủ ở nhiệt độ phũng 10 phỳt.
Bƣớc 2: Thờm 560 l ethanol trộn trong 15 giõy.
Bƣớc 3: Thờm 630 l dung dịch trờn vào cột ly tõm QIAamp đặt trong tube ly tõm 2ml, ly tõm 8000 vũng/ phỳt, loại bỏ tube ly tõm.
Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc 3.
Bƣớc 5: Thờm 500 l đệm AW1 vào cột ly tõm, ly tõm 8000 vũng/1phỳt
Bƣớc 6: Thờm 500 l đệm AW2 vào cột ly tõm, ly tõm 14000 vũng/ 1 phỳt, loại bỏ tube ly tõm.
Bƣớc 7: Thờm 60 l đệm AVE ủ 2 phỳt ở nhiệt độ phũng, ly tõm 8000 vũng/ 1 phỳt . Phần dịch thu đƣợc chứa ARN.
* Phản ứng RT-PCR + Nƣớc đó khử ion 75 l + Reaction mix 2x 12,5 l + Tap polymerase 1 l + Mồi xuụi 0.5 l + Mồi ngƣợc 0,5 l + ARN 3,0 l Tổng cộng: 25,0 l
Cho cỏc mẫu vào mỏy PCR với chu kỳ nhiệt nhƣ sau: + 01 chu kỳ 450C/ 30‟ : tổng hợp cDNA
+ 01 Chu kỳ 940C/5‟: Triệt tiờu toàn bộ ARN cũn lại + Chu kỳ:
940C/15‟‟: Biến tớnh 580C/30‟‟: Gắn mồi 680C: Kộo dài
+ 01 chu kỳ: 680C/5‟: kộo dài + Giữ ở 40
C
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trờn gel agarose 2% với hiệu điện thế 100V trong khoảng 30 phỳt, nhuộm ethidium bromide trong 5 phỳt rồi rửa bằng nƣớc cất. Sau khi nhuộm, vạch ADN sẽ phỏt sỏng dƣới đốn cực tớm.
2.6.4 Xỏc định trỡnh tự đoạn gien N bằng phương phỏp sequencing
2.6.4.1.Tinh sạch sản phẩm PCR.
A. Quy trỡnh tinh sạch sản phẩm PCR: Sản phẩm ARN sau khi
đƣợc tổng hợp sẽ đƣợc tinh khiết bằng bộ kit Wizard SV gel and PCR clean up System (Promega) theo quy trỡnh của nhà sản xuất:
(1) Thờm 50 l dung dịch Membrade Binding Solution vào týp chứa sản phẩm PCR ( 50 l)
(2) Đặt cột lọc (SV Minicolumn) vào týp 2ml sạch
(3) Hỳt hỗn hợp dịch Membrade Binding Solution và sản phẩm PCR vào cộc lọc, ủ tại nhiệt độ phũng trong vũng 1 phỳt.
(4) Tiến hành ly tõm ở 14.000 rpm/1 phỳt, chuyển cột lọc ra ngoài và loại bỏ dịch lọc trong týp, đặt cột lọc trở lại týp.
(5) Rửa cột lọc bằng cỏch thờm 700 l dung dịch rửa Membrane Wash Solution, ly tõm ở 14.000 rpm/1 phỳt, loại bỏ dịch lọc trong týp và đặt cột lọc trở lại týp. Tiến hành rửa lần 2, thờm 500 l dung dịch rửa Membrane Wash Solution, ly tõm ở 14000 rpm/5 phỳt.
(6) Chuyển cột lọc ra khỏi mỏy ly tõm, cẩn thận trỏnh làm ƣớt đỏy cột với dịch lọc bờn dƣới týp. Loại bỏ dịch lọc, đặt cột lọc trở lại và tiến hành ly tõm trong 1 phỳt với nắp mở để bay hơi nốt lƣợng ethanol cũn dƣ.
(7) Cẩn thận chuyển cột lọc sang týp 1.5ml sạch. Thờm 50 l nƣớc (Nuclease – free Water) trực tiếp vào giữa cột, trỏnh chạm đầu cụn vào màng lọc. Ủ tại nhiệt độ phũng trong vũng 1 phỳt. Ly tõm ở 14.000 vũng/1 phỳt
(8) Loại bỏ cột lọc và thu giữ sản phẩm tinh sạch PCR ( 50 l) trong týp 1.5ml. Lƣu giữ sản phẩm tinh sạch PCR tại 40C hoặc – 200C.
B. Quy trỡnh tổng hợp sản phẩm PCR - sequencing: Phản ứng
PCR – Sequencing đƣợc thực hiện với bộ kit BigDye Terminator 3.1 Cycle sequencing kit (Applied Biosystems)
Tổng hợp sản phẩm PCR - sequencing: tổng thể tớch 20 l của dung dịch bao gồm 2 l BigDye Terminator, 4 l đệm 5X Sequencing, 3.2 pM primer, 10-40 ng sản phẩm tinh sạch PCR. Trộn đều dung dịch và chạy chƣơng trỡnh Sequencing trờn mỏy PCR theo chu kỳ PCR/Sequencing
960C trong vũng 1 phỳt 25 chu kỳ tại 960
C trong 10 giõy, 500C trong 20 giõy, 600C trong 4 phỳt.
C. Quy trỡnh tinh sạch sản phẩm PCR - sequencing: Sản phẩm
PCR – Sequencing sau khi tổng hợp đƣợc tiến hành tinh sạch bằng bộ kit DyeEx 2.0 spin collum Qiagen theo cỏc bƣớc sau:
(1) Vortex nhẹ nhàng cột tinh sạch
(2) Nới lỏng nắp cột, điều này là cần thiết để trỏnh khoảng khụng bờn trong cột lọc
(3) Bẻ góy nắp đúng dƣới đỏy cột, và đặt cột lọc vào týp 2 ml (cú sẵn trong bộ kit)
(4) Ly tõm ở 750g/ 3 phỳt
(5) Cẩn thận chuyển cột lọc sang týp ly tõm sạch. Nhỏ chậm sản phẩm PCR – Sequencing (10 – 20 l) lờn bề mặt của màng cột lọc
Chỳ ý: Nhỏ sản phẩm trực tiếp vào giữa bề mặt màng cột lọc. Khụng đƣợc để sản phẩm hoặc đầu cụn chạm lờn thành cột lọc. Sản phẩm đƣợc nhỏ
từ từ thành giọt để hấp thu lờn bề mặt màng cột lọc và khụng chảy sang bờn cạnh bề mặt màng cột lọc. Trỏnh chạm đầu cụn lờn bề mặt màng cột lọc.
(6) Ly tõm ở 750g/3 phỳt
(7) Loại bỏ cột lọc và thu giữ sản phẩm tinh sạch trong týp ly tõm.
D. Giải trỡnh tự và phõn tớch trỡnh tự gien
(1) Nhỏ toàn bộ mỗi sản phẩm PCR-Seq tinh sạch vào mỗi giếng của tấm, đậy nắp và cho vào mỏy Sequence.
(2) Sản phẩm đƣợc giải mó bằng mỏy Sequencer ABI 3100. Cỏc trỡnh tự quang phổ đƣợc lắp đặt bằng phần mềm Sequencer.
(3) Phõn tớch, kết nối trỡnh tự và vẽ cõy di truyền bằng phần mềm Lasergiene, BioEdit và Mega4.
2.7. Phõn tớch số liệu
Nhập, xử lý, phõn tớch số liệu bằng chƣơng trinh Excel, SPSS.
Tớnh toỏn phõn tớch số liệu dựa vào cỏc thuật toỏn khi bỡnh phƣơng, để so sỏnh cỏc biến định tớnh với mức ý nghĩa thống kờ p< 0,05.
Tớnh toỏn, phõn tớch và xỏc định kiểu gien của vi rỳt bằng cỏc phần mềm Lasergiene, BioEdit và Mega4.
Phõn tớch và xỏc định mối liờn quan về dịch tễ học phõn tử giữa cỏc chủng vi rỳt sởi lƣu hành ở tỉnh Nghệ An cới cỏc tỉnh trong khu vực và trong nƣớc trƣớc, sau chiến dịch tiờm vắc xin sởi mũi 2 và mũi bổ xung bằng phần mềm Lasergiene, BioEdit và Mega4.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU
3.1. Tỡnh hỡnh sốt phỏt ban nghi sởi ở tỉnh Nghệ An từ 1/2009- 6/2011.
Căn cứ vào số liệu cụ thể mắc và chết do sốt phỏt ban nghi sởi của tỉnh Nghệ An ba năm 2009 đến thỏng 6 năm 2011, chỳng tụi quy sang tỷ lệ mắc, chết/ 100.000 dõn.
Bảng 3.1: Tỷ lệ mắc, tử vong trờn nhúm bệnh nhõn phỏt ban nghi sởi ở Nghệ An từ năm 1/2009 - 6/2011. Năm Tổng số mắc Tỷ lệ chết Tỷ lệ mắc/100.000 Tỷ lệ chết/100.000 2009 400 0 12,9 0 2010 304 0 10,4 0 2011 19 0 0 Cộng 3 năm 723 0 11,6 0 Nhận xột:
Năm 2009 cú 400 bệnh nhõn phỏt ban nghi sởi, tỷ lệ 12,9/100.000 dõn, khụng cú trƣờng hợp nào tử vong.
Năm 2010 cú 304 bờnh nhõn phỏt ban nghi sởi sởi chiếm tỷ lệ 10,4/100.000 dõn, khụng cú trƣờng hợp nào tử vong.
Năm 2011 số bệnh nhõn phỏt ban nghi sởi giảm hẳn, trong 6 thỏng đầu năm chỉ phỏt hiện cũn 19 ngƣời bệnh phỏt ban nghi sởi.
3.1.1. Mựa bị bệnh.
Trong 723 trƣờng hợp phỏt ban nghi sởi đƣợc bỏo cỏo ở tỉnh Nghệ An chỳng tụi lấy 475 mẫu mỏu (Cỏc bệnh nhõn theo tiờu chuẩn của TCYTTG) chiếm tỷ lệ 65,7%.
Biểu đồ 3.1. Số bệnh nhõn phỏt ban nghi sởi được thu thập mẫu mỏu phõn bố theo thỏng trong năm.
Nhận xột: Cỏc trƣờng hợp sốt phỏt ban nghi sởi gặp rải rỏc ở tất cả cỏc thỏng trong năm nhƣng tập trung cao nhất vào thỏng 5 và thấp nhất từ thỏng 6 đến thỏng 10.
3.1.2. Phõn bố bệnh nhõn theo địa dư.
Bảng 3.2. Cỏc bệnh nhõn sốt phỏt ban nghi sởi được lấy mỏu phõn bố theo địa dư.
STT Huyện/Thị Số lƣợng Tỷ lệ % 1 Kỳ Sơn 1 0,21 2 Nghi Kim 1 0,21 3 Quỳ Hợp 1 0,21 4 Nghi Phỳ 3 0,63 5 Nghĩa Đàn 3 0,63 6 Đụ Lƣơng 4 0,84 7 Quỳ Chõu 7 1,47 8 Thanh Chƣơng 8 1,68 9 Quế Phong 10 2,11 10 Cửa Lũ 13 2,74 11 Hƣng Nguyờn 13 2,74 12 Yờn Thành 17 3,58 13 Nghi Lộc 36 7,58 14 Quỳnh Lƣu 50 10,53 15 Diễn Chõu 60 12,63 16 Nam Đàn 93 19,58 17 TP Vinh 155 32,63 Tổng cộng 475 100,0 Nhận xột:
Cỏc ca bệnh phõn bố ở 17/20 huyện thị trong tỉnh Nghệ An, tập trung cao nhất ở Thành phố Vinh chiếm tỷ lệ 32,6% sau đú là ở cỏc huyện Nam Đàn (19,6%), Diễn Chõu (12,6%), Quỳnh lƣu (10,5%).
10 huyện miền nỳi: Quế phong, Quỳ chõu, Kỳ sơn, Nghĩa Đàn, Anh Sơn, Đụ Lƣơng …khụng cú hoặc chỉ xuất hiện rải rỏc nờn khụng thu thập đƣợc mẫu.
3.2. Kết quả xột nghiệm huyết thanh học và một số yếu tố dịch tễ liờn quan.
Sốt phỏt ban nghi sởi cú thể do vi rỳt sởi gõy ra và cũng cú thể do căn nguyờn vi rỳt khỏc. Để tỡm hiểu tỏc nhõn vi rỳt sởi gõy bệnh, cỏc mẫu mỏu của bệnh nhõn đƣợc thu thập và xột nghiệm để xỏc định căn nguyờn.
3.2.1. Kết quả xỏc định khỏng thể IgM khỏng vi rỳt sởi.
Để phỏt hiện khỏng thể IgM khỏng vi rỳt sởi, chỳng tụi sử dụng kỹ thuật ELISA theo thƣờng quy của bộ kớt Behring Enzygnost anti Measles vi rỳt IgM.
Bảng 3.3. Kết quả xỏc định khỏng thể IgM khỏng Sởi từ 1/2009 - 6/ 2011 tại tỉnh Nghệ An. Năm KẾT QUẢ Dƣơng tớnh n (%) Âm tớnh n (%) Nghi ngờ n (%) Tổng n (%) 2009 185 (79,0) 30 (12,8) 19 (8,1) 234 (49,3) 2010 98 (44,1) 110 (49,5) 14 (6,3) 222 (46,7) 2011 0 (0) 19 (100.0) 0 (0) 19 (4,0) Tổng n( %) 283 (59,6) 159 (33,5) 33 (6,9) 475 (100,0)
Biểu đồ 3.2. Phõn bố bệnh nhõn theo kết quả xột nghiệm ở cỏc năm Từ 1/ 2009 đến 6/2011
Nhận xột:
Qua xột nghiệm 475 mẫu huyết thanh của bệnh nhõn sốt phỏt ban nghi sởi cú 283 mẫu dƣơng tớnh chiếm tỷ lệ 59,6 %, 195 mẫu õm tớnh chiếm tỷ lệ 33,5 %. Tỷ lệ mẫu cú kết quả khụng rừ (khụng đủ số lƣợng, tan huyết hoặc cú kết quả nghi ngờ) chiếm 6,9%.
Năm 2009 số mẫu dƣơng tớnh cao 185 bệnh nhõn chiếm tỷ lệ 79%. Năm 2010 số mẫu dƣơng tớnh thấp 98 bệnh nhõn chiếm tỷ lệ 44,1%. 6 thỏng đầu năm 2011 khụng cú mẫu dƣơng tớnh với vi rỳt sởi.
3.2.2 Phõn tớch đặc điểm dịch tễ học trờn nhúm bệnh nhõn cú kết quả huyết thanh học dương tớnh với vi rỳt sởi. huyết thanh học dương tớnh với vi rỳt sởi.
3.2.2.1. Phõn bố bệnh nhõn theo nhúm tuổi và giới tớnh.
Bảng 3.4. Bệnh nhõn sởi theo nhúm tuổi và giới tớnh
Tuổi Nam Nữ Tổng số P n TL % n TL % n TL % < 1 18 69.23 8 30.77 26 9.19 < 0,05 1 – 4 67 55,37 54 44,63 121 42.76 5 – 9 56 53.85 48 46.15 104 36.75 10 – 14 5 55.56 4 44.44 9 3.18 ≥ 15 11 47.83 12 52.17 23 8.13 Tổng 157 55,47 126 44,52 283 100 >0,05
Nhận xột: Trong 382 mẫu mỏu của bệnh nhõn dƣơng tớnh với sởi.
Tỷ lệ bệnh nhõn nam là 55,47% và bệnh nhõn nữ chiếm 44,52 %. Sự khỏc biệt này khụng cú ý nghĩa thống kờ với P> 0,05.
Biểu đồ 3.3 Phõn bố bệnh nhõn mắc sởi theo lứa tuổi
Nhận xột:
Lứa tuổi từ 1- 9 tuổi bị bệnh sởi nhiều nhất trong đú nhúm tuổi 1- 4 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (42,76%), tiếp theo là lứa tuổi 5-9 tuổi( 36,75%).
Sự khỏc biệt này cú ý nghĩa thống kờ với p < 0,05
3.2.2.2. Phõn bố cỏc bệnh nhõn mắc sởi theo vựng địa lý.
Nhận xột: Kết quả phõn tớch bệnh nhõn sởi theo ba vựng thành thị, đồng bằng và miền nỳi cho thấy tỷ lệ bệnh nhõn ở thành thị và đồng bằng mắc là chớnh, chiếm 43% và 49,5% theo trỡnh tự. Ở miền nỳi chỉ cú 21 bệnh nhõn mắc bệnh chiếm tỷ lệ 7,4%.
(Tỉnh Nghệ An thành thị gồm cú: Thành phố Vinh, TX Cửa lũ, TX Thỏi Hũa. Cú 10 huyện miền nỳi: Nghĩa Đàn, Quỳ Hợp, Quỳ Chõu, Quế phong, Đụ Lƣơng, Con Cuụng, Anh Sơn, Tƣơng Dƣơng, Kỳ Sơn, Tõn Kỳ. Cỏc huyện cũn lại thuộc vựng đồng bằng).
Biểu đồ 3.5. Phõn bố bệnh nhõn sởi theo vựng địa lý.
Nhận xột:
Mẫu huyết thanh dƣơng tớnh với vi rỳt sởi tập trung cao nhất ở TP Vinh (106 bệnh nhõn) sau đú là cỏc huyện Diễn Chõu (40 bệnh nhõn), Nghi Lộc (30 bệnh nhõn) Quỳnh Lƣu (28 bệnh nhõn). Cỏc huyện miền nỳi của tỉnh Nghệ An nhƣ Quỳ Chõu, Quỳ Hợp, Quế Phong, Nghĩa Đàn, Kỳ Sơn, Đụ Lƣơng …mặc dự cú tỷ lệ dƣơng tớnh với sởi cao nhƣng khụng phỏt thành dịch mà chỉ mang tớnh tản phỏt.
3.2.2.3. Phõn tớch đặc điểm dịch tễ học cỏc bệnh nhõn sởi theo tiền sử tiờm vắc xin.
Biểu đồ 3.6. Phõn bố bệnh nhõn sởi theo tỡnh trạng tiờm vắc xin.
Nhận xột:
Trong tổng số 283 bệnh nhõn dƣơng tớnh với vi rỳt sởi thỡ cú 147 bệnh nhõn khụng đƣợc tiờm phũng vắc xin chiếm tỷ lệ 51,9%.
Cú 95 bệnh nhõn đƣợc tiờm một mũi vắc xin chiếm tỷ lệ 33,6%. Số bệnh nhõn khụng nhớ rừ tiền sử tiờm chủng vắc xin bị bệnh chiếm tỷ lệ 13,8%.
2 bệnh nhõn đƣợc ghi nhận là mới tiờm vắc xin sởi mũi 2 sau 1 tuần thỡ bị bệnh chiếm tỷ lệ 0,07%.
3.3.4. Phõn bố theo mựa.
Biểu đồ 3.7. Phõn bố bệnh nhõn mắc sởi theo thỏng trong cỏc năm từ 1/2009- 6/2011
Nhận xột: Theo kết quả trờn cho thấy sởi xuất hiện rải rỏc trong năm, thỏng cao điểm nhất về dịch sởi là thỏng 3, cú 3 đỉnh phụ vào thỏng 1, thỏng 5 và thỏng 11.
Biểu đồ 3.8. Phõn bố bệnh nhõn mắc sởi theo từng thỏng trong cỏc năm từ 1/2009-6 /2011.
Nhận xột: Năm 2009 cỏc mẫu dƣơng tớnh phõn bố ở tất cả cỏc thỏng trong năm, nhƣng tập trung cao ở thỏng 3 (41 trƣờng hợp) và thỏng 11 (26 trƣờng hợp).
Vụ dịch sởi năm 2010 là tiếp theo của vụ dịch sởi năm 2009, số bệnh nhõn dƣơng tớnh tập trung cao ở thỏng 1(40 trƣờng hợp), sau đú giảm nhanh chúng nhƣng vẫn lƣu hành gõy bệnh đến thỏng 12 của năm.
Sang năm 2011 khụng cú trƣờng hợp nào dƣơng tớnh với sởi.
3.3. Kết quả phõn lập vi rỳt sởi
Bảng 3.5 Kết quả phõn lập mẫu bệnh phẩm trờn dũng tế bào Vero/ SLAM
Năm Tổng Kết quả Số lƣợng bệnh nhõn (+)/CPE TL (%) Số lƣợng bệnh nhõn (-)/CPE TL (%) 2009 5 4 80,0 1 20,0 2010 19 5 26,3 14 73,7 2011 6 0 0,0 6 100,0 TL (%) 9 30,0 21 70.0 Nhận xột:
Trong 3 năm 2009-2011 đó thu thập đƣợc 30 mẫu bệnh phẩm dịch ngoỏy họng của bệnh nhõn sốt phỏt ban nghi sởi. Kết quả phõn lập vi rỳt trờn tế bào cho thấy cú 9 mẫu dƣơng tớnh chiếm tỷ lệ 30%, trong đú cú 4/5 mẫu bệnh phẩm năm 2009 và 5/19 mẫu bệnh phẩm năm 2010 dƣơng tớnh trờn dũng tế bào Vero/SLAM, năm 2011 khụng cú mẫu nào dƣơng tớnh.
Hỡnh 3.1: Hỡnh ảnh hủy hoại tế bào do vi rỳt sởi.
3.4. Kết quả khuếch đại chuỗi gien
Bảng 3.6. Kết quả xỏc định vi rỳt sởi: sử dụng kỹ thuật RT - PCR đặc hiệu vi rỳt sởi
Tổng số mẫu Dƣơng tớnh Âm tớnh
n TL (%) n TL (%) 5 (2009) 4 80,0 1 20,0 19 (2010) 19 100,0 0 0 6 (2011) 0 0 6 100,0 30 23 77,0 7 23,0 Nhận xột:
Năm 2009 lấy 5 mẫu (4 chủng và 1 mẫu dịch ngoỏy họng miệng) khuếch đại chuỗi gien kết quả 4/5 mẫu dƣơng tớnh.
Năm 2010 lấy 19 mẫu (5 chủng và 14 mẫu dịch ngoỏy họng) kết quả cú 19 /19 mẫu dƣơng tớnh.
Năm 2011 lấy 6 mẫu dịch ngoỏy họng khuếch đại chuỗi gien cả 6 mẫu đều cú kết quả õm tớnh.
Nhƣ vậy, trong tổng số 30 mẫu bệnh phẩm đƣợc xỏc định vi rỳt sởi bằng kỹ thuật RT-PCR đó cú tới 23 mẫu dƣơng tớnh, chiếm tỷ lệ 77%. Kết quả cho thấy kỹ thuật RT- PCR cú độ nhạy và độ đặc hiệu cao, nờn ỏp dụng cho chẩn đoỏn dịch bệnh sớm.
Bảng 3.7. So sỏnh 2 phương phỏp ELISA phỏt hiện khỏng thể IgM và RT – PCR
Thời gian Lấy mẫu n Dƣơng tớnh ELISA Dƣơng tớnh RT- PCR < 4 ngày 16 3/16 (18,8%) 11/16 (68,8%) 4 -7 ngày 14 12/14 (85,7%) 12/14 (85,7) Tổng 30 15/30 ( 50%) 23/30 (76,7%)
Nhận xột: Trong tổng số 30 bệnh nhõn lấy dịch ngoỏy họng miệng trong vũng 7 ngày sau phỏt ban chỳng tụi đồng thời lấy mỏu làm ELISA và RT- PCR kết quả nhƣ sau:
- Sốt phỏt ban dƣới 4 ngày cú 16 bệnh nhõn thỡ cú 18, 8% mẫu dƣơng tớnh khi sử dụng kỹ thuật ELISA, 68,8% mẫu dƣơng tớnh khi sử dụng kỹ thuật RT-PCR.
- Sốt phỏt ban từ 4- 7 ngày cú 14 bệnh nhõn cả hai kỹ thuật ELISA và RT- PCR đều cú tỷ lệ dƣơng tớnh cao 85,7%.
3.5. Kết quả giải trỡnh tự gien.
Sau khi chạy phản ứng giải trỡnh tự gien, sản phẩm đƣợc phõn tớch