1.2.1. Protein và thành phần trích ly chứa nitơ phi proteintừ động vật thủy sản
Protein từ động vật thủy sản
Được cấu tạo từ các axit amin, hầu hết các axit amin này quyết định giá trị dinh dưỡng của thực phẩm. Protein của ngũ cốc thường thiếu lysine và các axit amin có chứa lưu huỳnh (methionine, cysteine), trong khi protein của cá và động vật thủy sản khác là nguồn giàu các axit amin này. Do đó, protein từ động vật thủy sản có giá trị dinh dưỡng cao hơn các loại ngũ cốc khác.
Có thể chia protein của mô cơ cá ra thành 3 nhóm: - Protein cấu trúc (Protein tơ cơ)
Gồm các sợi myosin, actin, actomyosin và tropomyosin, chiếm khoảng 65 -75% tổng hàm lượng protein trong cá và khoảng 77 - 85% tổng hàm lượng protein trong mực. Các protein cấu trúc này có chức năng co rút đảm nhận các hoạt động của cơ. Myosin và actin là các protein tham gia trực tiếp vào quá trình co duỗi cơ. Protein cấu trúc có khả năng hòa tan trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion khá cao (>0,5M) [16].
- Protein chất cơ (Protein tương cơ)
Gồm myoglobin, myoalbumin, globulin và các enzym, chiếm khoảng 25-30% hàm lượng protein trong cá và 12-20% trong mực. Các protein này hòa tan trong nước, trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion thấp (<0,15M). Hầu hết protein chất cơ bị đông tụ khi đun nóng trong nước ở nhiệt độ trên 50oC. Trong quá trình chế biến và bảo quản, myoglobin dễ bị oxy hóa thành metmyoglobin, ảnh hưởng đến màu sắc của sản phẩm [16].
- Protein mô liên kết:
Bao gồm các sợi collagen, elastin. Hàm lượng colagen ở cơ thịt cá thấp hơn ở động vật có vú, thường khoảng 1 - 10% tổng lượng protein và 0,2 - 2,2% trọng lượng của cơ thịt. Chiếm khoảng 3% ở cá xương và khoảng 10% ở cá sụn (so với 17% trong các loài động vật có vú. Có trong mạng lưới ngoại bào, không tan trong nước, dung dịch kiềm hoặc dung dịch muối có nồng độ ion cao [16].
Thành phần trích ly chứa nitơ phi proteintừ động vật thủy sản
Chất phi protein là thành phần hòa tan trong nước, có khối lượng phân tử thấp và chiếm khoảng 9-18% tổng hàm lượng protein ở cá xương, khoảng 33-38% ở các loài cá sụn. Thành phần chính của hợp chất này bao gồm các chất bay hơi (amoniac, amine, trimethylamin, dimethylamin), trimethylamineoxid (TMAO), dimethylamineoxid (DMAO), creatin, các acid amin tự do, nucleotit, urê (có nhiều trong cá sụn) ... [6]
Thành phần chất trích ly chứa nitơ phi protein khác nhau phụ thuộc vào loài, kích cỡ, mùa vụ, phần cơ lấy mẫu, …
Các chất trích ly chứa nitơ phi protein rất quan trọng đối với các nhà chế biến thuỷ sản bởi vì chúng ảnh hưởng đến mọi tính chất của thực phẩm như: màu sắc, mùi vị, trạng thái cấu trúc, dinh dưỡng, sự an toàn và sự hư hỏng sau thu hoạch.
- Trimethylamin oxyt (TMAO)
TMAO là thành phần đặc trưng và quan trọng của nhóm chất chứa nitơ phi protein. TMAO có chủ yếu trong các loài cá nước mặn và ít được tìm thấy trong các loài cá nước ngọt. Hàm lượng TMAO trong cá khác nhau tùy theo loài, điều kiện sinh sống, kích cỡ. Cá hoạt động bơi lội nhiều, kích cỡ lớn chứa nhiều TMAO hơn cá nhỏ, ít bơi lội trong nước. Hàm lượng TMAO chứa cao nhất trong các loài cá sụn (cá nhám) và mực, chiếm khoảng 75 - 250 mgN/100g, cá tuyết chứa ít hơn (60 - 120 mgN/100g) [6].
Theo Tokunaga (1970), hàm lượng TMAO ở cá nổi như cá trích, cá thu, cá ngừ tập trung cao nhất trong cơ thịt sẫm (vùng tối), trong khi đó các loài cá đáy thịt trắng có hàm lượng TMAO cao hơn nhiều trong cơ thịt màu sáng. TMAO có vai trò điều hòa áp suất thẩm thấu của cá, vì vậy giúp cá chống lại áp suất thẩm thấu gây ra do sự chênh lệch nồng độ muối trong nước biển.
- Các axit amin tự do
Các axit amin tự do chiếm khoảng 0,5 - 2% trọng lượng cơ thịt, chúng góp phần tạo nên mùi vị thơm ngon đặc trng của nguyên liệu [6]. Hàm lượng axit amin tự do
càng nhiều thì vi khuẩn gây hư hỏng phát triển càng nhanh và sinh ra mùi ammoniac. Các loài cá có cơ thịt sẫm và thường vận động như cá ngừ, cá thu có hàm lượng histidine cao. Cơ thịt sẫm chứa histidin nhiều hơn cơ thịt trắng. Trong thời gian bảo quản, histidine bị vi sinh vật khử nhóm carboxyl hình thành độc tố histamine.
- Urê
Urê có phổ biến trong tất cả cơ thịt cá, nhưng nói chung có ít hơn 0,05% trong cơ thịt của cá xương, các loài cá sụn biển có chứa một lượng lớn urê (1 - 2,5%) [6]. Trong quá trình bảo quản, urê phân huỷ thành NH3 và CO2 dưới tác dụng của enzym urease của vi sinh vật. Do urê hoà tan trong nước và thấm qua màng tế bào nên nó dễ được tách ra khỏi miếng phi lê.
- Amoniac
Amoniac có mùi đặc trưng (mùi khai). Trong cơ thịt của cá tươi có một lượng nhỏ amoniac. Trong cá xương, lượng amoniac thấp nhưng khi bị hư hỏng do vi sinh vật thì lượng amoniac tăng nhanh. Khi sự hư hỏng tiến triển, pH của cơ thịt chuyển sang môi trường kiềm do lượng amoniac tăng lên và tạo nên mùi ươn thối của cá . - Creatine
Là thành phần chính của hợp chất phi protein. Cá ở trạng thái nghỉ ngơi creatine tồn tại dưới dạng mạch vòng phospho và cung cấp năng lượng cho quá trình co cơ .
1.2.2. Tách chiết protein từ thủy sản bằng phương pháp điều chỉnh pH
Nguyên lý của phương pháp
Tách chiết protein từ cơ thịt đỏ cá ngừ bằng phương pháp điều chỉnh pH thực chất là quá trình dựa vào khả năng hòa tan và kết tủa của protein tại điểm đẳng điện.
Điểm đẳng điện pI là giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa về điện. ở giá trị pH = pI phân tử protein trung hòa về điện sẽ không chuyển dịch trong điện trường, phân tử protein sẽ kém bền nhất dễ kết tủa.
Điểm đẳng điện pI của protein cá vào khoảng pH 4,5-5,5. Tại giá trị pH này, protein có độ hòa tan thấp nhất.
Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chiết protein bằng phương pháp điều chỉnh pH
Quá trình tách chiết protein bằng phương pháp điều chỉnh pH nhằm giải phóng protein từ nguyên liệu ra môi trường để khai thác protein trong nguyên liệu. Trong quá trình tách chiết để đạt được hiệu quả cao cần lưu ý các yếu tố ảnh hưởng sau [8].
- pH của dung môi chiết
Đối với táchchiết protein trong mô hoặc tế bào sống pH có ảnh hưởng rất lớn. Mỗi loại protein có khả năng hòa tan trong những pH dung môi nhất định, tuy nhiên trong nguyên liệu là các loại tế bào sống nó lại chứa tới hàng nghìn loại protein. Vì vậy, phải làm cách nào để chọn loại dung môi thích hợp để có thể hòa tan hầu hết các loại protein trong nguyên liệu.
Độ tan của protein thấp nhất ở pH = pI của nó, độ tan của protein tăng lên khi pH nằm xa pI vì khi pH = pI thì phân tử protein không tích điện cho nên chúng không có lực đẩy tĩnh điện và dễ bị đông kết. Khi pH khác pI thì các phân tử protein tích điện cùng dấu và đẩy nhau cho nên không không bị đông kết do đó độ tan tăng lên.
- Nhiệt độ của dung môi chiết
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong quá trình tách chiết nói chung và protein nói riêng. Khi thay đổi nhiệt độ làm thay đổi tốc dộ phản ứng theo chiều hướng tăng, giảm thường thì sự thay đổi nhiệt độ tỷ lệ thuận với tốc độ phản ứng. Tốc dộ phản ứng tăng khi nhiệt dộ tăng trong khoảng từ 0 – 40oC, khi tăng nhiệt độ lên sự chuyển động hỗn loạn của các phân tử tăng hay nói cách khác khuếch tán phân tử diễn ra mạnh hơn. Khác với các chất vô cơ, protein bị thay đổi nhiều khi dưới tác dụng của nhiệt độ. Ở nhiệt độ trên 400C hầu hết các liên kết của protein với các phân tử khác bị phá vỡ, quá trình tách chiết sẽ giải phóng protein ra môi trường. Khi nhiệt độ tăng lên 70-75oC thì protein trong nguyên liệu bị đông tụ gây khó khăn trong quá trình tách chiết. Biến tính của protein bởi nhiệt độ cao là biến tính không thuận nghịch, chính vì thế trong công nghệ tách và thu hồi protein thường nâng đến nhiệt độ vừa phải để đảm bảo đặc tính của protein.
Như vậy, khi tăng nhiệt độ đến giới hạn phù hợp sẽ tăng cao hiệu quả tách chiết, rút ngắn thời gian tách chiết.
- Thời gian hòa tan
Thời gian tách chiết càng dài thì sự tiếp xúc giữa cơ chất và dung môi càng dài, là điều kiện để các phản ứng xảy ra. Theo lý thuyết thời gian dài thì hiệu quả tách chiết tăng lên, tuy nhiên như đã nói ở trên khi đạt đến trạng thái cân bằng hoặc gần tới thì phản ứng xảy ra là vô cùng chậm, nếu tính về lượng protein hòa tan vào dung môi có thể tăng lên nhưng không đáng kể và hiệu quả cũng không cao. Trong quá tách chiết protein bằng phương pháp điều chỉnh pH thì tốc độ của quá trình chủ yếu ở giai đoạn
đầu và chậm lại ở thời gian sau. Khi thời gian càng dài về sau thì tốc độ càng chậm và thậm chí ở một số dung môi thời gian dài sẽ gây ảnh hưởng tới cấu trúc cũng như đặc tính của protein. Đó là lý do tại sao cần kiểm soát thời gian tách chiết thích hợp.
- Vận tốc khuấy đảo
Cũng như ảnh hưởng của nhiệt độ, sự khuấy đảo có liên quan đến sự chuyển động của phân tử protein và dung môi. Sự khuấy đảo có thể làm tăng tốc độ tách chiết do sự gia tăng tốc độ phản ứng nhưng cũng có thể là do khả năng bứt đứt hoặc làm yếu các liên kết giữa protein với các thành phần khác trong tế bào dưới tác dụng cơ học, làm tăng khả năng hòa tan protein.
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu.
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu ảnh hưởng tới sự chênh lệch nồng độ chất tan và khả năng tiếp xúc giữa nguên liệu và dung môi. Khi tăng tỷ lệ này lên thì tốc độ phản ứng tăng lên tuy nhiên sau quá trình chiết sẽ có quá trình phân riêng, sẽ rất khó khăn và tốn kém nếu thể tích sau chiết quá cao, vì vậy cần chọn tỷ lệ này phù hợp.
Biến đổi của protein trong quá trình tách chiết protein bằng phương pháp điều chỉnh pH
Protein sau khi bị tách khỏi tế bào một phần đã bị cắt đứt các liên kết với các loại khác, đồng thời bị chuyển từ các cấu trúc bậc cao sang cấu trúc bậc thấp hơn kèm theo các tính chất tự nhiên ban đầu bị mất đi, thậm chí thành các axit amin tùy vào mục đích chuyến đi [6].Như vậy, sau tách chiết mạch protein bị duỗi ra và để lộ các đầu ưa nước và kỵ nước, số nhóm kỵ nước sẽ tăng lên làm biến đổi đáng kể một số tính chất của protein.
Khi nhiệt độ vừa phải thì protein chỉ bị biến tính nhẹ, các mạch peptit duỗi ra, các liên kết protein – protein, giữa protein với các thành phần khác bị phá vỡ sẽ làm enzym dễ tác dụng, tăng hiệu suất trích ly[6].
Khi nhiệt độ cao thì sẽ phá hủy các liên kết trong tế bào, thủy phân các hợp chất hữu cơ, gây biến tính không thuận nghịch đối với protein.
Vì vậy, phải nghiên cứu tìm ra các chế độ thích hợp làm giảm các biến đổi protein trong quá trình tách chiết, tạo ra protein có chất lượng tốt và hiệu suât cao để ứng dụng vào sản xuất các sản phẩm thực phẩm có giá trị kinh tế và dinh dưỡng..
1.2.3. Ứng dụng protein tách chiết protein từ động vật thủy sản bằng phương pháp điều chỉnh PH pháp điều chỉnh PH
Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu tách chiết protein từ cá, tôm, mực… bằng phương pháp điều chỉnh pH. Đặc biệt, Batista(1998) đã nghiên cứu khai thác protein từ nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến cá tuyết và ứng dụng protein tách chiết được sử dụng làm surimi có hiệu quả [35]. Hutin và cộng sự cũng có rất nhiều công trình nghiên cứu tách chiết protein từ mực, cá… và ứng dụng rotein thu được để bổ sung vào các loại bánh, thức ăn cho tôm, surimi [36, 37, 38, 43]… Bên cạnh đó, Palafox và cộng sự (2009) nghiên cứu sử dụng phương pháp điều chỉnh pH để thu hồi protein từ phế liệu mực và ứng dụng bổ sung vào thực phẩm để tăng hàm lượng protein [39].
Tại Việt Nam trước tình hình ngành chế biến cá tra, cá basa phát triển mạnh mẽ với đặc điểm là ngành này sinh ra một lượng nước thải chứa một lượng máu và mỡ cao khó sử lý và dễ gây ô nhiễm. Do đó, Trang Sĩ Trung đã tiến hành nghiên cứu sử dụng phương pháp điều chỉnh pH về điểm đẳng điện để thu hồi protein từ dịch thải và ứng dụng vào thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi [21]. Bên cạnh đó, Trang Sĩ Trung và cộng sự (2008) cũng đã nghiên cứu ứng dụng chitozan thu hồi protein từ nước rửa surimi[22]. Hà Mỹ Thụân (2008), Nghiên cứu và khai thác sử dụng protein có trong đâù tôm ứng dụng bổ sung vào thực phẩm [20].
Một vài năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu tận dụng nguồn phế liệu thủy sản để sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng. Tuy nhiên, với sự phát triển của ngành chế biến thủy sản, nguồn nguyên liệu thừa là cơ thịt đỏ tại các công ty chế biến là rất lớn và giàu dinh dưỡng. Chính vì vậy, nghiên cứu tách chiết protein từ cơ thịt đỏ cá ngừ bằng phương pháp điều chỉnh pH và bước đầu ứng dụng protein thu được này vào sản xuất thử nghiệm xúc xích.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất 2.1.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Nguyên vật liệu
2.1.1.1. Cơ thịt đỏ cá ngừ
Cơ thịt đỏ cá của cá ngừ mắt to được mua từ công ty trách nhiệm hữu hạn Hoàng Hải, 298 đường 2 tháng 4, TP Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa.
Hình 2.1. Thịt đỏ cá ngừ đại dương
Tại công ty cơ thịt đỏ này được đông thành block 10kg/block ở chế độ đông nhanh, nhiệt độ tâm sản phẩm ≤ -18oC, bảo quản ở nhiệt độ -20 ± 2oC. Sau khi thu mua các block cơ thịt đỏ cá ngừ được bảo quản trong thùng cách nhiệt và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 20 phút. Tại phòng thí nghiệm, các block này được cưa thành những miếng nhỏ 500g và cho vào mỗi túi pE một miếng. Sau đó, đem bảo quản đông ở nhiệt độ -20oC ± 2oC để làm thí nghiệm.
Khi tiến hành thí nghiệm, nguyên liệu được được lấy từ tủ bảo quản mỗi túi pE 500g rồi rã đông dưới vòi nước chảy. Sau đó đem nguyên liệu đi xay nhỏ đồng nhất để lấy mẫu làm thí nghiệm.
2.1.1.2. Thịt heo
Thịt heo là một trong các thành phần nguyên liệu chính để sản xuất xúc xích. Trong đề tài sử dụng thịt heo nạc và mỡ, mua tại chợ Vĩnh Hải, Nha Trang đảm bảo chỉ tiêu chất lượng TCVN 7046- 2002 [24].
2.1.1.3. Carrageenan
Carrageenan sử dụng trong đề tài là loại dùng trong thực phẩm được mua tại phòng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ Chế biến đại học Nha Trang. Đạt tiêu chuẩn chất lượng về: độ nhớt, sức đông...
2.1.1.4. Gelatin
Gelatin sử dụng trong nghiên cứu là loại dùng trong thực phẩm được sản xuất bởi công ty TNHH hóa chất Guangdong Guanghua Chemical.
2.1.1.5. Bột mì
Bột mì sử dụng trong nghiên cứu là loại đạt tiêu chuẩn chất lượng dùng trong thực phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng TCVN 4359-86 được sản xuất bởi công ty TNHH lương thực thực phẩm Thành Phố Hồ Chí Minh [23].
2.1.2.6. Vỏ bao xúc xích
Bao bì làm xúc xích Nojax EP FU210, đường kính 21 mm, nhập khẩu từ Pháp được nhập khẩu bởi công ty TNHH P Tech, TP.HCM.
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này là loại hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích thí nghiệm.
2.1.2.1. Dung dịch acid clohydride
Dung dịch HCl đậm đặc (36-38%), được mua từ công ty công ty TNHH hóa chất Guang zhou Jinhuada Chemical Reagent.
2.1.2.2. Natri hydroxit
NaOH tinh thể, độ tinh khiết 96%, được mua từ công ty TNHH hóa chất Guang