Phƣơng pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng

Cl. perfringens phân lập đƣợc

2.4.8.1. Phương pháp xác định khả năng gây dung huyết

Các chủng vi khuẩn cần kiểm tra đƣợc ria cấy trực tiếp trên môi trƣờng

thạch máu (có bổ sung 7% máu cừu), nuôi ở điều kiện yếm khí 370C/24 giờ,

đọc kết quả. Căn cứ vào đặc điểm dung huyết trên môi trƣờng để đánh giá

mức độ dung huyết. Dung huyết  là dạng dung huyết mờ, không hoàn toàn

(do độc tố ). Hầu hết các chủng đều có khả năng tạo ra dung huyết này.

Dung huyết  (do độc tố ) là dạng dung huyết trong hoàn toàn. Dung huyết

đôi (dung huyết kép): Gồm có vùng dung huyết hoàn toàn  phía trong và

vùng dung huyết không hoàn toàn  phía ngoài.

2.4.8.2. Xác định yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Cl. perfringens phân lập được bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

Theo Songer J.G, (1996) [57] xác định týp độc tố (toxinotyp) bằng phản ứng multiplex PCR thông qua các cặp mồi cpa, cpb, etx, iA nhƣ sau:

* Cách tiến hành

Các chủng vi khuẩn Cl. perfringens phân lập đƣợc đều thực hiện qua 2

phản ứng multiplex PCR để xác định các loại độc tố chính do chúng sản sinh ra, từ đó có thể phân loại typ của các vi khuẩn này.

+ Phản ứng 1: Dùng để xác định các loại độc tố ,  và độc tố đƣờng

ruột (etx).

+ Phản ứng 2: Dùng để xác định các loại độc tố , 2 và . Có thể tóm tắt các phản ứng này nhƣ sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- AND đích: Là một lƣợng nhỏ khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần xác định đã đƣợc nuôi cấy trên đĩa thạch máu cừu, để tủ ấm 370

C trong 24 giờ trong điều kiện yếm khí.

- Mồi của phản ứng PCR : Trình tự các nucleotide của mồi đƣợc trình bày ở bảng sau:

Bảng 2.1. Trình tự các Nucletide của các mồi dùng để xác định một số loại độc tố chính của vi khuẩn Cl. perfringens

Ký hiệu

Primers Chuỗi Primers (5'-3') Kích cỡ sản phẩm (bp)

cpa 5'-GCTAATGTTACTGCCGTTGA - 3' 5'- CCTCTGATACATCGTGTAAG-3' 324bp cpb 5'-GCGAATATGCTGAAATCATCTA-3' 5'-GCAGGAACATTAGTAGTATATCTTC3' 196bp etx 5'-GCGGTGATATCCATCTATTC-3' 5'-CCACTTACTTGTCCTACTAC-3' 655bp iA 5'-ACTACTCTCAGACAAGACAG-3' 5'-CTTTCCTTCTATTACTATACG-3' 446bp

- Các chu kỳ nhiệt của phản ứng:

Bảng 2.2. Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR

Các giai đoạn của phản ứng Nhiệt độ (0C)

Thời gian

(phút) Số chu kỳ nhiệt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Giai đoạn biến tính 94 1

40

Giai đoạn bắt cặp 50 1

Giai đoạn tổng hợp 72 1

Giai đoạn kéo dài 72 7 1

- Chạy điện di: Sản phẩm PCR thu đƣợc sau chu trình phản ứng đƣợc nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) với mẫu theo tỷ lệ 1:5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR đƣợc chạy điện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch đệm TAE (Tris - agartate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút. Đây là cách để cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên lý các phân tử acid nucleic trong môi trƣờng pH trung tính thì tích điện âm nhờ các nhóm phốt phát nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleic. Khi đặt chúng vào điện trƣờng, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dƣơng. Khi tiến hành phân tích trên thạch agarose, các phân tử acid nucleic tuỳ theo kích thƣớc sẽ chuyển dịch với tốc độ khác nhau: loại phân tử có kích thƣớc lớn chạy chậm, loại có kích thƣớc bé chuyển dịch nhanh hơn.

- Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy điện di đƣợc nhuộm màu bằng chất

nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (BEt 1l/ml) trong vòng 15 phút.

BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trí cố định của các nhóm có khoảng cách gần với bazơ, tạo ra một lƣợng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử BEt tự do.

- Đọc kết quả: Bằng cách quan sát dƣới ánh đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Geldoc. Trên ảnh chụp nền đen các loại acid nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh đƣợc và ghi nhận lại. Kích thƣớc các băng DNA đƣợc so sánh với DNA chuẩn (DNA marker), đƣợc cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, các cạnh giếng dùng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

phát hiện sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà ngƣời ta có thể xác định đƣợc độ dài của đoạn sản phẩm PCR.

2.4.8.3. Kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được trên chuột bạch

Để xác định độc lực của các vi khuẩn gây bệnh, có thể thực hiện bằng phƣơng pháp tiêm truyền qua động vật thí nghiệm (Baldassi và cs, 2004 [40]).

Các bƣớc thực hiện nhƣ sau:

- Bƣớc 1: Vi khuẩn thuần từ môi trƣờng giữ giống đƣợc cấy chuyển vào môi trƣờng nƣớc thịt gan yếm khí. Bồi dƣỡng trong điều kiện yếm khi ở 370C/24 giờ

- Bƣớc 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, bỏ phần cặn, lấy

nƣớc trong ở trên (độc tố) để thử độc lực trên chuột. Tiêm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiên cứu cho 3 chuột nhắt trắng khoẻ mạnh (trọng lƣợng từ 18- 20g/con), với liều tiêm là 0,2ml/chuột vào xoang phúc mạc. Lô đối chúng gồm 3 chuột đƣợc tiêm nƣớc sinh lý hoặc dung dịch BHI với liều tiêm và đƣờng tiêm tƣơng tự.

- Bƣớc 3: Kiểm tra và theo dõi thời gian chết, số lƣợng chuột trong vòng 7 ngày. Căn cứ vào số lƣợng chuột chết, giờ chuột chết bình quân của mỗi lô để đánh giá độc lực của vi khuẩn. Đồng thời tiến hành mổ khám, phân lập lại vi khuẩn từ máu tim của các chuột chết.