chủng Cl. perfringens phân lập đƣợc
2.4.7.1. Kiểm tra hình thái học và sự bắt mầu của vi khuẩn
Cách làm tiêu bản: dùng phiến kính sạch, trong, ngâm trong cồn, hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng que cấy vô trùng lấy một giọt dịch vi khuẩn mọc ở gần đáy môi trƣờng, đặt lên phiến kính, dàn đều dịch vi khuẩn. Làm khô và cố định tiêu bản: có thể để khô tự nhiên hoặc hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn.
Nhuộm tiêu bản theo phƣơng pháp nhuộm Gram.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Trên môi trƣờng thạch máu yếm khí: Sau 24giờ ở tủ ấm 370C trong điều kiện yếm khí, vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc tròn, gọn, mờ đục, xung quanh có vùng dung huyết.
- Môi trƣờng Litmus milk: Môi trƣờng sữa có 7% chỉ thị Litmus.
Mẫu canh khuẩn cần kiểm tra đƣợc cấy chuyển vào môi trƣờng, bồi dƣỡng trong điều kiện yếm khí ở 370C/24giờ. Phản ứng dƣơng tính khi vi khuẩn lên men đƣờng trong sữa chuyển từ mầu xanh sang mầu hồng, sinh acid làm đông vón casein, làm mất màu chất chỉ thị và sinh nhiều hơi.
- Môi trƣờng CW ( có bổ sung 4% lòng đỏ trứng): Sau 24-48 giờ nuôi ở tủ yếm khí 370C, vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc tròn, gọn, mặt vồng, màu trắng, hơi vàng, vùng đổ môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc mờ đục, môi trƣờng thạch chuyển từ mầu cam thành mầu vàng tƣơi.
2.4.7.3. Thử phản ứng CAMP test ngược trên môi trường thạch máu.
Một đặc điểm của vi khuẩn Cl. perfringens là gây dung huyết kép trên
thạch máu, để xác định khả năng này ngƣời ta làm phản ứng CAMP ngƣợc để
giám định sự có mặt của vi khuẩn.
* Phương pháp
Chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae đƣợc cấy thành 1 đƣờng thẳng ngang qua mặt đĩa thạch máu cừu. Sau đó chủng vi khuẩn Cl. perfringens
kiểm tra đƣợc cấy theo một đƣờng vuôn góc với đƣờng cấy vi khuẩn
Streptococcus agalactie (nhƣng không đƣợc chạm vào đƣờng cấy vi khuẩn
Streptococcus agalactie). Tiến hành nuôi cấy trong điều kiện yếm khí ở 370C/24giờ.
* Đọc kết quả
+ Phản ứng dƣơng tính: Vùng dung huyết ở gần chỗ tiếp xúc giữa 2 đƣờng cấy sẽ có hình mũi tên rõ ràng do 1 loại yếu tố khuếch tán có trong vi khuẩn Streptococcus agalactie tiết ra đã làm tăng khả năng dung huyết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
bán phần (không hoàn toàn) có trong vi khuẩn Cl. perfringens do độc tố
sản sinh ra.
+ Phản ứng âm tính: Không quan sát thấy dung huyết hình mũi tên.
2.4.7.4. Kiểm tra khả năng di động, sinh H2S, sinh Indol trên môi trường SIM
Cấy trích sâu vi khuẩn vào môi trƣờng thạch SIM, bồi dƣỡng trong điều kiện yếm khí ở 370C trong 24 giờ. Quan sát sự phát triển của vi khuẩn dọc
theo đƣờng cấy để đánh giá khả năng di động, sinh H2S. Đồng thời nhỏ thuốc
thử Kovac's để quan sát khả năng sản sinh Indol.
2.4.7.5. Kiểm tra đặc tính lên men các loại đường
Môi trƣờng để kiểm tra là môi trƣờng nƣớc thịt peptone (10g/l) có thêm chỉ thị màu Andrade (1%)
Cách tiến hành: Môi trƣờng nƣớc peptone đã hấp vô trùng, đem nhỏ
đƣờng sau đó để tủ ấm 370C/24giờ. Quan sát sự đổi màu của môi trƣờng để
xác định khả năng lên men đƣờng và lƣợng khí trong ống Durham để xác định khả năng sinh hơi.
2.4.7.6. Kiểm tra khả năng sinh Indol
Nguyên lý: Một số vi khuẩn có khả năng sinh Tryptophanase. Nếu trong môi trƣờng nuôi cấy có Tryptophanase thì Tryptophanase sẽ phân giải Tryptophanase tạo Indol. Indol kết hợp với Paradimeltyl benzaldehid có trong thuốc thử Kovac's tạo thành một hợp chất màu đỏ có thể dễ dàng nhận biết bằng mắt thƣờng.
Khuẩn lạc giữ trên thạch yếm khí đƣợc cấy vào môi trƣờng SIM, bồi
dƣỡng ở điều kiệm yếm khí 370C/24giờ. Trƣớc khi nhỏ thuốc thử Kovac's thì
phải bỏ lớp paraffin ở phía trên của ống môi trƣờng SIM.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Phản ứng dƣơng tính: Xuất hiện một vòng tròn đỏ ở phía trên + Phản ứng âm tính: Không xuất hiện vòng tròn đỏ.