Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Cl. perfringens ở lợn
2.3.2.1. Xác định tỷ lệ mang trùng ở lợn
2.3.2.2. Phân lập vi khuẩn Cl. perfringens ở các bệnh phẩm của lợn chết nghi
mắc bệnh viêm ruột hoại tử
2.3.2.3.Giám định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Cl. perfringens phân lập đƣợc 2.3.2.4. Xác định số lƣợng vi khuẩn Cl. perfringens trong phân lợn bệnh và lợn bình thƣờng
2.3.2.5. Xác định serotype vi khuẩn Cl. perfringens bằng phản ứng PCR.
2.3.2.6. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn Cl. perfringens phân lập đƣợc bằng cách tiêm truyền động vật thí nghiệm.
2.3.2.7. Xác định khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn
Cl. perfringens phân lập đƣợc
2.3.3. Thử nghiệm phác đồ phòng và điều trị bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn dƣới 60 ngày tuổi dƣới 60 ngày tuổi dƣới 60 ngày tuổi
2.3.3.1. Kết quả thử nghiệm vacxin phòng bệnh
2.3.3.2. Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị lợn mắc bệnh viêm ruột hoại tử cho lợn dƣới 60 ngày tuổi.
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ
Sử dụng phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive study), dịch tễ học phân tích (Analytic Study) và dịch tễ học thực nghiệm (Nguyễn Nhƣ Thanh (2001 [31]).
2.4.2. Phƣơng pháp thực hiện
- Trực tiếp quan sát để phát hiện lợn tiêu chảy nghi VRHT. Những lợn phân lỏng đƣợc coi là bị tiêu chảy (loại trừ những lợn bị bệnh truyền nhiễm có triệu chứng tiêu chảy).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Thông tin điều tra đƣợc ghi vào các phiếu điều tra.
2.4.3. Nội dung điều tra, theo dõi
- Số lợn mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại các hộ, các trang trại chăn nuôi.
- Các triệu chứng thƣờng gặp ở lợn mắc tiêu chảy.
- Các bệnh tích ở lợn mắc tiêu chảy khi tiến hành mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm
- Phƣơng thức chăn nuôi và việc thực hiện vệ sinh chuồng trại
2.4.4. Các chỉ tiêu theo dõi trong dịch tễ
Tỷ lệ VRHT (%) = Số lợn VRHT x 100 Tổng số lợn điều tra Tỷ lệ VRHT theo độ tuổi (%) = Số lợn VRHT theo từng độ tuổi x 100 Tổng số lợn điều tra Tỷ lệ chết do VRHT (%) = Số lợn chết do VRHT x 100 Tổng số lợn điều tra mắc bệnh VRHT
2.4.5. Phƣơng pháp thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn
2.4.5.1. Thu thập mẫu * Mẫu phân
- Mẫu phân phân lập vi khuẩn: Những lợn tiêu chảy nghi mắc VRHT chƣa dùng thuốc kháng sinh điều trị. Đƣợc lấy trực tiếp từ trực tràng lợn, hoặc vừa đƣợc thải ra, khoảng 2 - 3 gam cho vào ống nghiệm vô trùng có nút vặn để tránh nhiễm trùng kế phát. Mẫu phân đƣợc bảo quản lạnh và đƣa ngay về phòng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo trong vòng 24h.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Mẫu phân để đếm số lƣợng vi khuẩn, lấy 2-3 gam phân từ hậu môn của các lợn bị mắc tiêu chảy nghi VRHT vào một túi nilon sạch, ghi ký hiệu mẫu.
* Mẫu bệnh phẩm
Theo khuyến cáo của Kohler B (1998) [51]: Nên dùng những chủng
CL. perfringens độc lập phân lập từ bệnh phẩm để chế sinh phẩm phòng bệnh, là có hiệu quả tốt nhất. Vì thế trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tập trung phân lập vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm của những lợn con bị tiêu chảy chủ yếu ở lứa tuổi 1 -21 ngày.
Lợn con bị bệnh, sắp chết hoặc vừa mới chết đƣợc lấy nguyên con, đƣa ngay về phòng thí nghiệm mổ khám vô trùng và cấy trực tiếp vào môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn. Mẫu bệnh phẩm gồm: Ruột non, gan, lách, thận, máu trong tim và hạch màng treo ruột. Trong trƣờng hợp không làm kịp các mẫu vật sẽ
đƣợc bảo quản vô trùng ở điều kiện nhiệt độ 40
C và không quá 4h.
2.4.5.2. Phương pháp phân lập
Vi khuẩn Cl. perfringens đƣợc tiến hành phân lập và giám định theo quy trình của NCCLS (1999) [44].
Các bƣớc nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn Cl. perfringens nhƣ sau:
- Bƣớc 1:
Lấy 1g mẫu phân cần nghiên cứu cho vào lọ có nắp, có chứa sẵn 10ml môi trƣờng nƣớc thịt TGC (sau khi đun nóng ở 1000C/30 phút và làm nguội nhanh để tạo điều kiện yếm khí). Giữ nhiệt ở 750C/25 phút trong bể nhiệt.
Làm nguội nhanh dƣới vòi nƣớc lạnh, rồi tiến hành nuôi cấy ở tủ ấm 370C/24-
48 giờ (mở hờ nắp lọ để khí gas sinh ra không làm nổ lọ).
- Bƣớc 2:
Sau 24 - 48 giờ, tiến hành ria cấy lên môi trƣờng CW (có bổ sung 4%
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lạc điển hình, có hình thái đặc trƣng của vi khuẩn Cl. perfringens nhƣ: khuẩn
lạc tròn, gọn, màu trắng, hơi vàng, có mặt vồng đặc trƣng, vùng môi trƣờng bao quanh khuẩn lạc mờ đục, có màu vàng, môi trƣờng thạch chuyển từ màu cam thành màu vàng tƣơi.
- Bƣớc 3:
Chọn khuẩn lạc có các đặc điểm nhƣ trên, tiến hành kiểm tra hình thái, tính chất bắt màu, xác định một số đặc tính nuôi cấy trên các môi trƣờng (Phản ứng CAMP test ngƣợc, Litmus milk, SIM) và các đặc tính lên men một số môi trƣờng đƣờng Arabinose, Fructose, Maltose, Glucose, Xylose, Saccarose). Sau đó tiến hành giữ giống trên môi trƣờng Cooked Meat (370C/24h). Với phƣơng pháp này, chủng vi khuẩn sau khi cấy và đƣợc bảo quản ở 40C có thể duy trì đƣợc tới 50 năm.
- Bƣớc 4:
Các chủng vi khuẩn, sau khi đƣợc phân lập và thuần nhất sẽ đƣợc tiến hành xác định các loại độc tố cơ bản bằng phản ứng PCR, trên cơ sở đó sẽ xác định typ của vi khuẩn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Mẫu
Nuôi trong tủ ấm 370C/24-48h
Khuẩn lạc màu trắng, hơi vàng, tròn, gọn, mặt vồng, vùng môi trƣờng bao xung quanh mờ
đục, màu vàng Tiêm chuột bạch Tiêm phúc xoang cho chuột bạch Đếm số trên thạch máu yếm khí Nƣớc thịt TGC (10ml) giữ ở 750C/25 phút
Lọc qua màng lọc Pha loãng
Thạch CW, có bổ sung 4% lòng đỏ trứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kiểm tra hình thái,
tính chất bắt màu Đặc tính nuôi cấy Đặc tính sinh hoá
- Phản ứng CAMP test - Litmus milk - SIM (H2S di động) - Indol - Lên men đƣờng (Arabinose, Fructose, Lactose, Maltose, Glucose, Xylose, Saccarose) Xác định độc tố bằng PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sơ đồ 2.1: Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn Cl. perfringens dựa trên quy trình của NCCLS, (1999) [44]
2.4.6. Phƣơng pháp xác định số lƣợng vi khuẩn Cl. perfringens trong 1
gam phân của lợn tiêu chảy nghi VRHT hoặc không tiêu chảy
Mẫu là 1g phân của lợn bị tiêu chảy hoặc không bị tiêu chảy, đƣợc
pha loãng trong dung dịch PBS thành các nồng độ 10-1
, 10-2, ..., 10-8. Lấy 0,1ml dung dịch ở các nồng độ đã pha loãng 10-6, 10-7, 10-8 nhỏ và dàn đều
trên bề mặt thạch máu Columbia-Blood-Agar Base. Bồi dƣỡng ở 370
C trong điều kiện yếm khí trong vòng 24h. Mỗi nồng độ pha loãng dùng 3 đĩa thạch. Đếm số khuẩn lạc Cl. perfringens mọc trên đĩa thạch, rồi tính trung bình cho mỗi nồng độ.
Số lƣợng vi khuẩn đƣợc tính theo công thức: X= 10 x a x b Trong đó:
X: Là tổng số lƣợng vi khuẩn có trong 1 gam phân hoặc chất chứa a: Là số lƣợng vi khuẩn trung bình của 1 nồng độ pha loãng
b: Hệ số pha loãng mẫu Hệ số 10: vì cấy 0,1ml
2.4.7. Phƣơng pháp giám định một số tính chất sinh vật, hoá học của các chủng Cl. perfringens phân lập đƣợc chủng Cl. perfringens phân lập đƣợc
2.4.7.1. Kiểm tra hình thái học và sự bắt mầu của vi khuẩn
Cách làm tiêu bản: dùng phiến kính sạch, trong, ngâm trong cồn, hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng que cấy vô trùng lấy một giọt dịch vi khuẩn mọc ở gần đáy môi trƣờng, đặt lên phiến kính, dàn đều dịch vi khuẩn. Làm khô và cố định tiêu bản: có thể để khô tự nhiên hoặc hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn.
Nhuộm tiêu bản theo phƣơng pháp nhuộm Gram.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Trên môi trƣờng thạch máu yếm khí: Sau 24giờ ở tủ ấm 370C trong điều kiện yếm khí, vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc tròn, gọn, mờ đục, xung quanh có vùng dung huyết.
- Môi trƣờng Litmus milk: Môi trƣờng sữa có 7% chỉ thị Litmus.
Mẫu canh khuẩn cần kiểm tra đƣợc cấy chuyển vào môi trƣờng, bồi dƣỡng trong điều kiện yếm khí ở 370C/24giờ. Phản ứng dƣơng tính khi vi khuẩn lên men đƣờng trong sữa chuyển từ mầu xanh sang mầu hồng, sinh acid làm đông vón casein, làm mất màu chất chỉ thị và sinh nhiều hơi.
- Môi trƣờng CW ( có bổ sung 4% lòng đỏ trứng): Sau 24-48 giờ nuôi ở tủ yếm khí 370C, vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc tròn, gọn, mặt vồng, màu trắng, hơi vàng, vùng đổ môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc mờ đục, môi trƣờng thạch chuyển từ mầu cam thành mầu vàng tƣơi.
2.4.7.3. Thử phản ứng CAMP test ngược trên môi trường thạch máu.
Một đặc điểm của vi khuẩn Cl. perfringens là gây dung huyết kép trên
thạch máu, để xác định khả năng này ngƣời ta làm phản ứng CAMP ngƣợc để
giám định sự có mặt của vi khuẩn.
* Phương pháp
Chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae đƣợc cấy thành 1 đƣờng thẳng ngang qua mặt đĩa thạch máu cừu. Sau đó chủng vi khuẩn Cl. perfringens (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
kiểm tra đƣợc cấy theo một đƣờng vuôn góc với đƣờng cấy vi khuẩn
Streptococcus agalactie (nhƣng không đƣợc chạm vào đƣờng cấy vi khuẩn
Streptococcus agalactie). Tiến hành nuôi cấy trong điều kiện yếm khí ở 370C/24giờ.
* Đọc kết quả
+ Phản ứng dƣơng tính: Vùng dung huyết ở gần chỗ tiếp xúc giữa 2 đƣờng cấy sẽ có hình mũi tên rõ ràng do 1 loại yếu tố khuếch tán có trong vi khuẩn Streptococcus agalactie tiết ra đã làm tăng khả năng dung huyết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
bán phần (không hoàn toàn) có trong vi khuẩn Cl. perfringens do độc tố
sản sinh ra.
+ Phản ứng âm tính: Không quan sát thấy dung huyết hình mũi tên.
2.4.7.4. Kiểm tra khả năng di động, sinh H2S, sinh Indol trên môi trường SIM
Cấy trích sâu vi khuẩn vào môi trƣờng thạch SIM, bồi dƣỡng trong điều kiện yếm khí ở 370C trong 24 giờ. Quan sát sự phát triển của vi khuẩn dọc
theo đƣờng cấy để đánh giá khả năng di động, sinh H2S. Đồng thời nhỏ thuốc
thử Kovac's để quan sát khả năng sản sinh Indol.
2.4.7.5. Kiểm tra đặc tính lên men các loại đường
Môi trƣờng để kiểm tra là môi trƣờng nƣớc thịt peptone (10g/l) có thêm chỉ thị màu Andrade (1%)
Cách tiến hành: Môi trƣờng nƣớc peptone đã hấp vô trùng, đem nhỏ
đƣờng sau đó để tủ ấm 370C/24giờ. Quan sát sự đổi màu của môi trƣờng để
xác định khả năng lên men đƣờng và lƣợng khí trong ống Durham để xác định khả năng sinh hơi.
2.4.7.6. Kiểm tra khả năng sinh Indol
Nguyên lý: Một số vi khuẩn có khả năng sinh Tryptophanase. Nếu trong môi trƣờng nuôi cấy có Tryptophanase thì Tryptophanase sẽ phân giải Tryptophanase tạo Indol. Indol kết hợp với Paradimeltyl benzaldehid có trong thuốc thử Kovac's tạo thành một hợp chất màu đỏ có thể dễ dàng nhận biết bằng mắt thƣờng.
Khuẩn lạc giữ trên thạch yếm khí đƣợc cấy vào môi trƣờng SIM, bồi
dƣỡng ở điều kiệm yếm khí 370C/24giờ. Trƣớc khi nhỏ thuốc thử Kovac's thì
phải bỏ lớp paraffin ở phía trên của ống môi trƣờng SIM.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Phản ứng dƣơng tính: Xuất hiện một vòng tròn đỏ ở phía trên + Phản ứng âm tính: Không xuất hiện vòng tròn đỏ.
2.4.8. Phƣơng pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn
Cl. perfringens phân lập đƣợc
2.4.8.1. Phương pháp xác định khả năng gây dung huyết
Các chủng vi khuẩn cần kiểm tra đƣợc ria cấy trực tiếp trên môi trƣờng
thạch máu (có bổ sung 7% máu cừu), nuôi ở điều kiện yếm khí 370C/24 giờ, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đọc kết quả. Căn cứ vào đặc điểm dung huyết trên môi trƣờng để đánh giá
mức độ dung huyết. Dung huyết là dạng dung huyết mờ, không hoàn toàn
(do độc tố ). Hầu hết các chủng đều có khả năng tạo ra dung huyết này.
Dung huyết (do độc tố ) là dạng dung huyết trong hoàn toàn. Dung huyết
đôi (dung huyết kép): Gồm có vùng dung huyết hoàn toàn phía trong và
vùng dung huyết không hoàn toàn phía ngoài.
2.4.8.2. Xác định yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Cl. perfringens phân lập được bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Theo Songer J.G, (1996) [57] xác định týp độc tố (toxinotyp) bằng phản ứng multiplex PCR thông qua các cặp mồi cpa, cpb, etx, iA nhƣ sau:
* Cách tiến hành
Các chủng vi khuẩn Cl. perfringens phân lập đƣợc đều thực hiện qua 2
phản ứng multiplex PCR để xác định các loại độc tố chính do chúng sản sinh ra, từ đó có thể phân loại typ của các vi khuẩn này.
+ Phản ứng 1: Dùng để xác định các loại độc tố , và độc tố đƣờng
ruột (etx).
+ Phản ứng 2: Dùng để xác định các loại độc tố , 2 và . Có thể tóm tắt các phản ứng này nhƣ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- AND đích: Là một lƣợng nhỏ khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần xác định đã đƣợc nuôi cấy trên đĩa thạch máu cừu, để tủ ấm 370
C trong 24 giờ trong điều kiện yếm khí.
- Mồi của phản ứng PCR : Trình tự các nucleotide của mồi đƣợc trình bày ở bảng sau:
Bảng 2.1. Trình tự các Nucletide của các mồi dùng để xác định một số loại độc tố chính của vi khuẩn Cl. perfringens
Ký hiệu
Primers Chuỗi Primers (5'-3') Kích cỡ sản phẩm (bp)
cpa 5'-GCTAATGTTACTGCCGTTGA - 3' 5'- CCTCTGATACATCGTGTAAG-3' 324bp cpb 5'-GCGAATATGCTGAAATCATCTA-3' 5'-GCAGGAACATTAGTAGTATATCTTC3' 196bp etx 5'-GCGGTGATATCCATCTATTC-3' 5'-CCACTTACTTGTCCTACTAC-3' 655bp iA 5'-ACTACTCTCAGACAAGACAG-3' 5'-CTTTCCTTCTATTACTATACG-3' 446bp
- Các chu kỳ nhiệt của phản ứng:
Bảng 2.2. Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
Các giai đoạn của phản ứng Nhiệt độ (0C)
Thời gian
(phút) Số chu kỳ nhiệt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Giai đoạn biến tính 94 1
40 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giai đoạn bắt cặp 50 1
Giai đoạn tổng hợp 72 1
Giai đoạn kéo dài 72 7 1
- Chạy điện di: Sản phẩm PCR thu đƣợc sau chu trình phản ứng đƣợc nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) với mẫu theo tỷ lệ 1:5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR đƣợc chạy điện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch đệm TAE (Tris - agartate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút. Đây là cách để cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên lý các phân tử acid nucleic trong môi trƣờng pH trung tính thì tích điện âm nhờ các nhóm phốt phát nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleic. Khi đặt chúng vào điện trƣờng, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dƣơng. Khi tiến hành phân tích trên thạch agarose, các phân tử acid nucleic tuỳ theo kích thƣớc sẽ chuyển dịch với tốc độ khác nhau: loại phân tử có kích thƣớc lớn chạy chậm, loại có kích thƣớc bé chuyển dịch nhanh hơn.
- Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy điện di đƣợc nhuộm màu bằng chất
nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (BEt 1l/ml) trong vòng 15 phút.
BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trí cố định của các nhóm có khoảng cách gần với bazơ, tạo ra một lƣợng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử BEt tự do.