Theo Taylor D.J (1986) [58], Bergenlad M.E (1986) [42]: Cl. perfringens
typ A đƣợc coi là một phần của phổ hệ vi sinh vật bình thƣờng ở lợn. Do yếu tố Stress nội sinh hay ngoại sinh nào đó làm cho sinh thái của phổ hệ mất cân bằng, từ đó tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển và gây bệnh đƣờng ruột. Từ những kết
quả thu thập đƣợc đã chứng tỏ sự liên quan của Cl. perfringens đến bệnh VRHT,
trong cả trƣờng hợp ỉa chảy ở lợn con và lợn thời kỳ đầu cai sữa.
* Mầm gây bệnh-toxin
Cl. perfringens typ A cũng giống nhƣ Cl. perfringens typ C, nhƣng khuẩn lạc của typ A trên môi trƣờng thạch máu tạo thành 2 vòng dung huyết đặc trƣng, vòng dung huyết ngoài tạo ra do α-toxin, còn vòng trong do γ-toxin. Một số Cl. perfringens typ A sản sinh ra độc tố ruột khi tạo nha bào
(dạng nha bào), có một số khác (Cl. perfringens typ A dạng dinh dƣỡng) sinh
ra độc tố ruột và thƣờng tạo ra nhiều độc tố α. Vì thế đã làm xuất hiện hai hội chứng có liên quan đến Cl. perfringens typ A. Cả hai nhóm tạo nha bào sản sinh độc tố ruột và nhóm tạo độc tố ruột sản sinh α-toxin khi ở dạng dinh dƣỡng đã đƣợc xác minh ở trên lợn (Taylor D.J (1986) [58], Bergeland M.E (1986) [42]).
* Đặc điểm dịch tễ
Vi khuẩn thƣờng tồn tại ở chất chứa trong đƣờng ruột và đất. Nha bào
có thể sống sót trong đá lạnh 00C và ở nƣớc sôi 1000C trong 10 phút, nhƣng
các tế bào dinh dƣỡng lại dễ bị tác động bởi nhiệt. Trong thực tế đặc điểm dịch tễ của bệnh do Cl. perfringens typ A gây ra ở lợn đến giờ vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều, vì thế còn nhiều điểm chƣa đƣợc làm sáng rõ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bệnh xảy ra ở các trang trại chăn nuôi và trong một số ổ lợn là sự kết hợp
của các nhóm Cl. perfringens typ A với các đặc tính sinh vật giống nhau. Tuy
nhiên cho đến nay ngƣời ta vẫn chƣa xác định một cách chắc chắn chúng thuộc
nhóm vi khuẩn Cl. perfringens typ A nào (Dạng nha bào hay dinh dƣỡng).
Theo Taylor D.J (1986) [58], Bergeland M.E (1986) [42] cho biết: Một
số nhóm Cl. perfringens typ A có gen sản sinh độc tố ruột (Entertoxin) có khả
năng gây ra ngộ độc thực phẩm cho ngƣời, thƣờng hay xảy ra với đồ ăn nguội là thịt lợn và cho đến bây giờ ngƣời ta vẫn chƣa biết một cách chính xác mối liên quan giữa các nhóm vi khuẩn gây ngộ độc cho ngƣời này với khả năng gây bệnh cho vật nuôi.
* Sinh bệnh học
Bệnh nhiễm khuẩn Cl. perfringens typ A thƣờng xảy ra ở lợn con sau
khi đẻ khoảng vài giờ, vi khuẩn có thể đƣợc tìm thấy ở ngay phân su. Trong chất chứa ruột (đoạn ruột chay, ruột hồi) có thể phát hiện đƣợc 108
- 109 CFU/g tƣơng đƣơng với số lƣợng vi khuẩn có trong ruột già và trong phân. Vi khuẩn dạng dinh dƣỡng (Vegerative forms) sản sinh độc tố α và có thể một số độc tố khác gây hoại tử ở tế bào biểu mô ruột của lợn trong gây bệnh thực nghiệm.
Dạng hình thành nha bào sản sinh độc tố ruột, gây hoại tử lông nhung khá nặng và hút nƣớc vào trong lòng ruột, độc tố cố định vào tế bào biểu mô của ruột kết, làm mất khả năng tái hấp thu nƣớc. Kháng thể của cả hai loại độc tố ruột này có trong sữa đầu, bệnh thƣờng quan sát đƣợc khi lợn con đã cai sữa lúc 5-7 tuần tuổi (Taylor D.J (1986) [58], Bergeland M.E (1986) [42])
* Triệu chứng lâm sàng
Lợn con mắc bệnh Cl. perfringens typ A dạng dinh dƣỡng, biểu hiện phân nhão nhƣ kem trong vòng 48 giờ sau khi sinh, lợn bệnh không bị sốt, da bụng biến màu trông giống các ca nhiễm Cl. perfringens typ A. Tiêu chảy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
thƣờng kéo dài tới 5 ngày, phân trong chuồng trông lầy nhầy và có thể có màu mận hồng, lợn bệnh thƣờng ít chết, sau khi khỏi còi cọc chậm phát triển.
Trƣờng hợp bệnh gây ra bởi Cl. perfringens typ A dạng nha bào, lợn bệnh tháo chảy ra nƣớc, kéo dài 24-48h. Đối với lợn cai sữa 5-7 tuần tuổi, thƣờng thấy ỉa chảy hoặc phân nhão khi nhiễm bệnh và kéo dài 4-7 ngày. Dạng ỉa chảy này lợn thƣờng ít chết nhƣng sau đó rất chậm phục hồi. Lợn mắc
bệnh thƣờng do ăn phải thức ăn bị ô nhiễm nha bào Clostridia.
* Biến đổi bệnh lý do Cl. perfringens typ A
Biến đổi bệnh lý đại thể quan sát đƣợc đó là: Lợn bị bệnh thƣờng biểu hiện mất nƣớc, thành ruột non dày, trong đó chất chứa tựa nhƣ bột nhão, rất hiếm trƣờng hợp thấy có máu, niêm mạc viêm nhẹ và có dính chút ít chất hoại tử. Trong ruột già cũng đầy chất chứa nhão, niêm mạc thƣờng là bình thƣờng hoặc thỉnh thoảng thấy có mảnh vụn hoại tử. Bệnh xảy ra trên lợn sau cai sữa rất ít thấy biến đổi bệnh lý trên niêm mạc ruột, nhƣng có thể thấy bọt và các chất chứa nhầy trong ruột.
Ruột non ở những lợn chết thƣờng xung huyết, chất chứa có nhiều dịch và nƣớc, nhƣng không có máu. Trên bề mặt niêm mạc không tràng và hồi tràng quan sát thấy các đám hoại tử. Những quan sát sau khi mổ khám không
thể chứng minh đƣợc là trƣờng hợp bệnh do viêm ruột Cl. perfringens typ A.
Tuy nhiên, điều này giúp phân biệt bệnh do Cl. perfringens typ B và C, vì những con bị bệnh không có hiện tƣợng ruột non có màu đỏ đậm. Ngoài hiện tƣợng xung huyết bên ngoài ruột và xác chết mầu thẫm, các biến đổi khác không rõ. Trong thể mãn tính, cũng có thể quan sát thấy một số biến đổi tƣơng tự Cl. perfringens. Cl. perfringens typ A có thể phân lập từ môi trƣờng nuôi cấy ruột non của những động vật bị bệnh viêm ruột do một số nguyên nhân
khác nhƣ bệnh viêm dạ dày ruột - ruột (TGE), rotavirus, cầu trùng và nhiễm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tuy nhiên Cl. perfringens typ A có thể gây teo lông nhung và có chứa chất nhày niêm mạc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Lợn con dƣới 60 ngày tuổi tại một số huyện của tỉnh Thái Nguyên - Vi khuẩn Cl. perfringens gây bệnh ở lợn tại Thái Nguyên.
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
- Các trang trại, hộ gia đình nuôi lợn tại các huyện Phú Bình, Đồng Hỷ và huyện Định Hóa thuộc tỉnh Thái Nguyên
- Phòng vi trùng, Trung tâm chẩn đoán thú y Trung Ƣơng
2.1.3. Thời gian nghiên cứu
- Từ tháng 8/2009 đến tháng 8/2010
2.2. NGUYÊN LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Mẫu nghiên cứu
- Mẫu là phân lợn tiêu chảy nghi mắc bệnh viêm ruột hoại tử: Đƣợc lấy trực tiếp từ trực tràng lợn, hoặc vừa đƣợc thải ra, khoảng 2 - 3 gam cho vào ống nghiệm vô trùng có nút vặn để tránh nhiễm trùng kế phát. Mẫu phân đƣợc bảo quản lạnh và đƣa ngay về phòng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo trong vòng 24h.
- Mẫu bệnh phẩm: Là phủ tạng gồm: Gan, lách, ruột của lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi mắc bệnh tiêu chảy vừa chết hoặc sắp chết.
- Các dụng cụ lấy mẫu đƣợc chuẩn bị trƣớc, đảm bảo vô trùng và tuân theo quy trình và phƣơng pháp lấy mẫu trong nghiên cứu vi sinh vật thú y.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.2. Các loại môi trƣờng, hoá chất
- Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các môi trƣờng thông thƣờng và một số loại thuốc thử do phòng vi trùng Trung tâm chẩn đoán thú y Trung Ƣơng cung cấp.
- Các môi trƣờng đặc biệt để nuôi cấy phân lập, giám định vi khuẩn yếm khí có nguồn gốc trong nƣớc hoặc ngoài nƣớc do Trung tâm chẩn đoán thú y Trung Ƣơng cung cấp.
- Các môi trƣờng sử dụng trong đề tài do hãng Oxoid của Anh, Diagnosis của Pháp
- Các loại giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid của Anh sản xuất.
- Các máy móc, dụng cụ và vật liệu cần thiết khác của Phòng vi trùng, Trung tâm chẩn đoán thú y Trung Ƣơng.
2.2.3. Động vật thí nghiệm
- Chuột bạch khoẻ mạnh, có trọng lƣợng trung bình từ 18-20g/con
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn dƣới 60 ngày tuổi tại tỉnh Thái Nguyên dƣới 60 ngày tuổi tại tỉnh Thái Nguyên
2.3.1.1. Tình hình bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn tại một số điểm nghiêm cứu tại tỉnh Thái Nguyên
2.3.1.2. Kết quả điều tra tình hình bệnh VRHT tại tỉnh Thái Nguyên theo mùa vụ 2.3.1.3. Điều tra tình hình bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên theo giai đoạn phát triển
2.3.1.4. Điều tra tình hình bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên theo phƣơng thức chăn nuôi theo phƣơng thức chăn nuôi
2.3.1.5. Triệu chứng lâm sàng ở lợn nghi mắc VRHT 2.3.1.6. Bệnh tích ở lợn chết do VRHT 2.3.1.6. Bệnh tích ở lợn chết do VRHT
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Cl. perfringens ở lợn
2.3.2.1. Xác định tỷ lệ mang trùng ở lợn
2.3.2.2. Phân lập vi khuẩn Cl. perfringens ở các bệnh phẩm của lợn chết nghi
mắc bệnh viêm ruột hoại tử
2.3.2.3.Giám định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Cl. perfringens phân lập đƣợc 2.3.2.4. Xác định số lƣợng vi khuẩn Cl. perfringens trong phân lợn bệnh và lợn bình thƣờng
2.3.2.5. Xác định serotype vi khuẩn Cl. perfringens bằng phản ứng PCR.
2.3.2.6. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn Cl. perfringens phân lập đƣợc bằng cách tiêm truyền động vật thí nghiệm.
2.3.2.7. Xác định khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn
Cl. perfringens phân lập đƣợc
2.3.3. Thử nghiệm phác đồ phòng và điều trị bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn dƣới 60 ngày tuổi dƣới 60 ngày tuổi dƣới 60 ngày tuổi
2.3.3.1. Kết quả thử nghiệm vacxin phòng bệnh
2.3.3.2. Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị lợn mắc bệnh viêm ruột hoại tử cho lợn dƣới 60 ngày tuổi.
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ
Sử dụng phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive study), dịch tễ học phân tích (Analytic Study) và dịch tễ học thực nghiệm (Nguyễn Nhƣ Thanh (2001 [31]).
2.4.2. Phƣơng pháp thực hiện
- Trực tiếp quan sát để phát hiện lợn tiêu chảy nghi VRHT. Những lợn phân lỏng đƣợc coi là bị tiêu chảy (loại trừ những lợn bị bệnh truyền nhiễm có triệu chứng tiêu chảy).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Thông tin điều tra đƣợc ghi vào các phiếu điều tra.
2.4.3. Nội dung điều tra, theo dõi
- Số lợn mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại các hộ, các trang trại chăn nuôi.
- Các triệu chứng thƣờng gặp ở lợn mắc tiêu chảy.
- Các bệnh tích ở lợn mắc tiêu chảy khi tiến hành mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm
- Phƣơng thức chăn nuôi và việc thực hiện vệ sinh chuồng trại
2.4.4. Các chỉ tiêu theo dõi trong dịch tễ
Tỷ lệ VRHT (%) = Số lợn VRHT x 100 Tổng số lợn điều tra Tỷ lệ VRHT theo độ tuổi (%) = Số lợn VRHT theo từng độ tuổi x 100 Tổng số lợn điều tra Tỷ lệ chết do VRHT (%) = Số lợn chết do VRHT x 100 Tổng số lợn điều tra mắc bệnh VRHT
2.4.5. Phƣơng pháp thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn
2.4.5.1. Thu thập mẫu * Mẫu phân
- Mẫu phân phân lập vi khuẩn: Những lợn tiêu chảy nghi mắc VRHT chƣa dùng thuốc kháng sinh điều trị. Đƣợc lấy trực tiếp từ trực tràng lợn, hoặc vừa đƣợc thải ra, khoảng 2 - 3 gam cho vào ống nghiệm vô trùng có nút vặn để tránh nhiễm trùng kế phát. Mẫu phân đƣợc bảo quản lạnh và đƣa ngay về phòng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo trong vòng 24h.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Mẫu phân để đếm số lƣợng vi khuẩn, lấy 2-3 gam phân từ hậu môn của các lợn bị mắc tiêu chảy nghi VRHT vào một túi nilon sạch, ghi ký hiệu mẫu.
* Mẫu bệnh phẩm
Theo khuyến cáo của Kohler B (1998) [51]: Nên dùng những chủng
CL. perfringens độc lập phân lập từ bệnh phẩm để chế sinh phẩm phòng bệnh, là có hiệu quả tốt nhất. Vì thế trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tập trung phân lập vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm của những lợn con bị tiêu chảy chủ yếu ở lứa tuổi 1 -21 ngày.
Lợn con bị bệnh, sắp chết hoặc vừa mới chết đƣợc lấy nguyên con, đƣa ngay về phòng thí nghiệm mổ khám vô trùng và cấy trực tiếp vào môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn. Mẫu bệnh phẩm gồm: Ruột non, gan, lách, thận, máu trong tim và hạch màng treo ruột. Trong trƣờng hợp không làm kịp các mẫu vật sẽ
đƣợc bảo quản vô trùng ở điều kiện nhiệt độ 40
C và không quá 4h.
2.4.5.2. Phương pháp phân lập
Vi khuẩn Cl. perfringens đƣợc tiến hành phân lập và giám định theo quy trình của NCCLS (1999) [44].
Các bƣớc nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn Cl. perfringens nhƣ sau:
- Bƣớc 1:
Lấy 1g mẫu phân cần nghiên cứu cho vào lọ có nắp, có chứa sẵn 10ml môi trƣờng nƣớc thịt TGC (sau khi đun nóng ở 1000C/30 phút và làm nguội nhanh để tạo điều kiện yếm khí). Giữ nhiệt ở 750C/25 phút trong bể nhiệt.
Làm nguội nhanh dƣới vòi nƣớc lạnh, rồi tiến hành nuôi cấy ở tủ ấm 370C/24-
48 giờ (mở hờ nắp lọ để khí gas sinh ra không làm nổ lọ).
- Bƣớc 2:
Sau 24 - 48 giờ, tiến hành ria cấy lên môi trƣờng CW (có bổ sung 4%
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lạc điển hình, có hình thái đặc trƣng của vi khuẩn Cl. perfringens nhƣ: khuẩn
lạc tròn, gọn, màu trắng, hơi vàng, có mặt vồng đặc trƣng, vùng môi trƣờng bao quanh khuẩn lạc mờ đục, có màu vàng, môi trƣờng thạch chuyển từ màu cam thành màu vàng tƣơi.
- Bƣớc 3:
Chọn khuẩn lạc có các đặc điểm nhƣ trên, tiến hành kiểm tra hình thái, tính chất bắt màu, xác định một số đặc tính nuôi cấy trên các môi trƣờng (Phản ứng CAMP test ngƣợc, Litmus milk, SIM) và các đặc tính lên men một số môi trƣờng đƣờng Arabinose, Fructose, Maltose, Glucose, Xylose, Saccarose). Sau đó tiến hành giữ giống trên môi trƣờng Cooked Meat (370C/24h). Với phƣơng pháp này, chủng vi khuẩn sau khi cấy và đƣợc bảo quản ở 40C có thể duy trì đƣợc tới 50 năm.
- Bƣớc 4:
Các chủng vi khuẩn, sau khi đƣợc phân lập và thuần nhất sẽ đƣợc tiến hành xác định các loại độc tố cơ bản bằng phản ứng PCR, trên cơ sở đó sẽ xác định typ của vi khuẩn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Mẫu
Nuôi trong tủ ấm 370C/24-48h
Khuẩn lạc màu trắng, hơi vàng, tròn, gọn, mặt vồng, vùng môi trƣờng bao xung quanh mờ
đục, màu vàng Tiêm chuột bạch Tiêm phúc xoang cho chuột bạch Đếm số trên thạch máu yếm khí Nƣớc thịt TGC (10ml) giữ ở 750C/25 phút
Lọc qua màng lọc Pha loãng
Thạch CW, có bổ sung 4% lòng đỏ trứng
Kiểm tra hình thái,
tính chất bắt màu Đặc tính nuôi cấy Đặc tính sinh hoá
- Phản ứng CAMP test - Litmus milk - SIM (H2S di động) - Indol - Lên men đƣờng (Arabinose, Fructose, Lactose, Maltose, Glucose, Xylose, Saccarose) Xác định độc tố bằng PCR