2.4.5.1. Thu thập mẫu * Mẫu phân
- Mẫu phân phân lập vi khuẩn: Những lợn tiêu chảy nghi mắc VRHT chƣa dùng thuốc kháng sinh điều trị. Đƣợc lấy trực tiếp từ trực tràng lợn, hoặc vừa đƣợc thải ra, khoảng 2 - 3 gam cho vào ống nghiệm vô trùng có nút vặn để tránh nhiễm trùng kế phát. Mẫu phân đƣợc bảo quản lạnh và đƣa ngay về phòng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo trong vòng 24h.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Mẫu phân để đếm số lƣợng vi khuẩn, lấy 2-3 gam phân từ hậu môn của các lợn bị mắc tiêu chảy nghi VRHT vào một túi nilon sạch, ghi ký hiệu mẫu.
* Mẫu bệnh phẩm
Theo khuyến cáo của Kohler B (1998) [51]: Nên dùng những chủng
CL. perfringens độc lập phân lập từ bệnh phẩm để chế sinh phẩm phòng bệnh, là có hiệu quả tốt nhất. Vì thế trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tập trung phân lập vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm của những lợn con bị tiêu chảy chủ yếu ở lứa tuổi 1 -21 ngày.
Lợn con bị bệnh, sắp chết hoặc vừa mới chết đƣợc lấy nguyên con, đƣa ngay về phòng thí nghiệm mổ khám vô trùng và cấy trực tiếp vào môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn. Mẫu bệnh phẩm gồm: Ruột non, gan, lách, thận, máu trong tim và hạch màng treo ruột. Trong trƣờng hợp không làm kịp các mẫu vật sẽ
đƣợc bảo quản vô trùng ở điều kiện nhiệt độ 40
C và không quá 4h.
2.4.5.2. Phương pháp phân lập
Vi khuẩn Cl. perfringens đƣợc tiến hành phân lập và giám định theo quy trình của NCCLS (1999) [44].
Các bƣớc nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn Cl. perfringens nhƣ sau:
- Bƣớc 1:
Lấy 1g mẫu phân cần nghiên cứu cho vào lọ có nắp, có chứa sẵn 10ml môi trƣờng nƣớc thịt TGC (sau khi đun nóng ở 1000C/30 phút và làm nguội nhanh để tạo điều kiện yếm khí). Giữ nhiệt ở 750C/25 phút trong bể nhiệt.
Làm nguội nhanh dƣới vòi nƣớc lạnh, rồi tiến hành nuôi cấy ở tủ ấm 370C/24-
48 giờ (mở hờ nắp lọ để khí gas sinh ra không làm nổ lọ).
- Bƣớc 2:
Sau 24 - 48 giờ, tiến hành ria cấy lên môi trƣờng CW (có bổ sung 4%
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lạc điển hình, có hình thái đặc trƣng của vi khuẩn Cl. perfringens nhƣ: khuẩn
lạc tròn, gọn, màu trắng, hơi vàng, có mặt vồng đặc trƣng, vùng môi trƣờng bao quanh khuẩn lạc mờ đục, có màu vàng, môi trƣờng thạch chuyển từ màu cam thành màu vàng tƣơi.
- Bƣớc 3:
Chọn khuẩn lạc có các đặc điểm nhƣ trên, tiến hành kiểm tra hình thái, tính chất bắt màu, xác định một số đặc tính nuôi cấy trên các môi trƣờng (Phản ứng CAMP test ngƣợc, Litmus milk, SIM) và các đặc tính lên men một số môi trƣờng đƣờng Arabinose, Fructose, Maltose, Glucose, Xylose, Saccarose). Sau đó tiến hành giữ giống trên môi trƣờng Cooked Meat (370C/24h). Với phƣơng pháp này, chủng vi khuẩn sau khi cấy và đƣợc bảo quản ở 40C có thể duy trì đƣợc tới 50 năm.
- Bƣớc 4:
Các chủng vi khuẩn, sau khi đƣợc phân lập và thuần nhất sẽ đƣợc tiến hành xác định các loại độc tố cơ bản bằng phản ứng PCR, trên cơ sở đó sẽ xác định typ của vi khuẩn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Mẫu
Nuôi trong tủ ấm 370C/24-48h
Khuẩn lạc màu trắng, hơi vàng, tròn, gọn, mặt vồng, vùng môi trƣờng bao xung quanh mờ
đục, màu vàng Tiêm chuột bạch Tiêm phúc xoang cho chuột bạch Đếm số trên thạch máu yếm khí Nƣớc thịt TGC (10ml) giữ ở 750C/25 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lọc qua màng lọc Pha loãng
Thạch CW, có bổ sung 4% lòng đỏ trứng
Kiểm tra hình thái,
tính chất bắt màu Đặc tính nuôi cấy Đặc tính sinh hoá
- Phản ứng CAMP test - Litmus milk - SIM (H2S di động) - Indol - Lên men đƣờng (Arabinose, Fructose, Lactose, Maltose, Glucose, Xylose, Saccarose) Xác định độc tố bằng PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sơ đồ 2.1: Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn Cl. perfringens dựa trên quy trình của NCCLS, (1999) [44]