Dựa theo phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn cá và động vật thuỷ sản của Frerichs (1993), Plumb & Bowser (bản dịch của Nguyễn Ngọc Nhiên, 1992 [14]), Bùi Quang Tề (1995) [15], Đỗ Thị Hoà (2005).[8]
Hình 2.2: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu bệnh do vi khuẩn 2.3.2.1. Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn:
2.3.2.1.1. Môi trường phân lập vi khuẩn: Môi trường:
- Môi trường nuôi cấy cơ bản: TSA (Tryptic Soy Agar), NB (Nutrient Broth) - Môi trường dùng cho thử các phản ứng sinh hóa:
Bộ kít API 20E, API 20STREP (bioMrieux, Pháp) và IDS 14 GNR (công ty Nam Khoa).
- O/F cơ bản để kiểm tra khả năng lên men và oxy hóa.
Mẫu cá
Thu mẫu bệnh phẩm (gan, thận, lách, vết loét)
Nuôi cấy thuần
Thử phản ứng sinh hoá Nhuộm gram
Định danh vi khuẩn
Thử kháng sinh đồ
Nuôi cấy phân lập
Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc
Thí nghiệm cảm nhiễm
- Manitol di động khử khả năng di động. Hóa chất:
- Hóa chất dùng nhuộm Gram vi khuẩn: crystal, lugol, cồn acetol, fuchsin. - Các loại đĩa giấy kháng sinh dùng trong thử kháng sinh đồ.
- Nước muối sinh lý, cồn 700.
2.3.2.1.2. Nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn
Mẫu bệnh phẩm (gan, thận, lách, vết loét) lấy từ cá bệnh, được rửa lại 2-3 lần bằng nước muối sinh lý 0,85%, sau đó cho vào ống nghiệm vô trùng và tán nhuyễn bằng đũa thủy tinh. Dùng que cấy hơ nóng dưới ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy bệnh phẩm cấy lên đĩa thạch chứa môi trường TSA. Cho đĩa thạch vào tủ ấm và quan sát kết quả sau 24h, yêu cầu trên bề mặt đĩa thạch phải xuất hiên các khuẩn lạc rời nhau. Dựa và hình dạng, màu sắc và kích thước khuẩn lạc để làm cơ sở xác định loài nghi ngờ.
Nuôi cấy loài thuần:
Tiến hành chọn những khuẩn lạc riêng lẻ và chiếm ưu thế trên bề mặt các đĩa thạch phân lập để nuôi cấy thuần loài. Dùng que cấy vô trùng để cấy loài thuần chuyển sang đĩa thạch khác, mục đích tạo số lượng lớn vi khuẩn để chuẩn bị cho việc thử các phản ứng sinh hóa làm cơ sở cho việc định danh vi khuẩn hoặc chuyển sang lưu giữ trong ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng TSA có nút đậy tiệt trùng. Không được dùng loài đã cấy chuyển quá 5 lần để hạn chế sự toái hóa và suy giảm độc lực của loài vi khuẩn cần sử dụng.
Lưu giữ loài thuần: có 2 cách lưu giữ loài:
Môi trường lỏng : dùng Micropipet hút khoảng 1ml dung dịch môi trường vào ống Ependord chứa môi trường NB (có chứa 20% Glycerol) rồi dùng que cấy lấy 1 khúm nhỏ khuẩn lạc vi khuẩn đã cấy thuần khuấy đều trong ống. Để trong tủ ấm lắc trong khoảng 100 vòng/ phút, sau 24 giờ đem lưu giữ trong tủ đông sâu -80oC. Thời gian lưu giữ khoảng 2 năm.
Môi trường thạch nghiêng (TSA): dùng que cấy đầu tròn lấy 1 khúm khuẩn lạc từ đĩa thạch đã được cấy thuần ria đều trên mặt thạch nghiêng, để trong tủ ấm 24 giờ cho vi khuẩn mọc đều rồi đem lưu giữ trong tủ lạnh. Bọc các ống nghiệm này trong giấy bạc và túi nhựa vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ 5-70C để lưu giống định danh sau.
Nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn: theo phương pháp của Plumb & Bowser (bản dịch của Nguyễn Ngọc Nhiên, 1992)
Nhằm mục đích xác định được hình thái, cách sắp xếp và đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn thông qua khả năng bắt màu thuốc nhuộm để xác định vi khuẩn là Gram dương (+) (bắt màu tím xanh) hay Gram âm (-) (bắt màu hồng).
Phương pháp: sau khi dùng que cấy đầu tròn đã vô trùng lấy vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy lỏng hay từ khuẩn lạc, hoặc từ các mô cá bệnh, dàn đều thành một lớp mỏng trên lam kính sạch cùng với 1 giọt nước muối sinh lý, để mẫu khô ở nhiệt độ phòng sau đó hơ cao tấm lam trên ngon lửa đèn cồn để làm chết vi khuẩn và gắn chúng vào lam, ghi etiket, sau đó tiến hành làm theo lần lượt các bước sau:
Nhuộm Crystal Violet (60 giây), rửa dưới vòi nước chảy nhẹ sau đó để khô. Nhuộm Lugol (60 giây), rửa dưới vòi nước chảy nhẹ sau đó để khô.
Rửa mẫu với Cồn- Acetone (15 giây) cho đến khi nhạt màu tím trên lam. Nhuộm Fucshin (60 giây) rồi rửa lại qua dòng nước chảy nhẹ.
Để khô tự nhiên rồi quan sát dưới vật kính dầu (100x). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thử các phản ứng sinh hóa để làm cơ sở cho việc định danh vi khuẩn:
Để định danh vi khuẩn còn phải thực hiện 1 chuỗi các phản ứng sinh hóa thông qua các bộ test kit:
Test kit API-20E (Analitical Profile Index) Test kit IDS 14 GNR
Test kit API-20STREP
Và hệ thống phân loại vi khuẩn của Holt và ctv (1994), Frerichs và Millar (1993). 2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu độ nhạy kháng sinh của vi khuẩn gây
bệnh:
Lập kháng sinh đồ theo phương pháp đĩa giấy của Kirby Bauer.
Loài vi khuẩn cần nghiên cứu phải được nuôi cấy trên đĩa thạch chứa môi trường TSA trước đó 24h. Dùng que cấy vô trùng tiến hành lấy các khúm khuẩn cho vào ống nghiệm vô trùng chứa nước muối sinh lý 0,85% để tạo dịch huyền phù, lắc nhẹ để vi khuẩn phân tán đều trong ống nghiêm đến khi đạt độ đục chuẩn MC Farlan 2.0, tương đương với 108 tế bào/ml.
Lấy 0,5 ml dung dịch huyền phù vi khuẩn láng đều trên mặt thạch các đĩa môi trường TSA bằng que cấy trang. Để khô 5-10 phút, đặt lên mặt thạch các đĩa kháng
sinh, khoảng 4-6 đĩa kháng sinh/ đĩa thạch, sao cho các đĩa kháng sinh cách nhau và cách thành đĩa 1,5-2cm.
Sau khi cấy, lật ngược hộp lồng đặt trong tủ ấm trong 24h. Độ nhạy của một loại kháng sinh đối với vi khuẩn phụ thuộc vào số đo đường kính vòng vô khuẩn. So sánh số đo này với độ nhạy chuẩn để xác định độ nhạy của kháng sinh.
2.3.2.3. Phương pháp gây cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh:
Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm cảm nhiễm bệnh do vi khuẩn
Bố trí thí nghiệm:
Cá thí nghiệm: Cá tầm cókích thước thương phẩm thu từ các trại nuôi, cá được nuôi thuần dưỡng trở lại. Chọn cá khoẻ đưa vào thí nghiệm.
Điều kiện nuôi: Mật độ: 10 con/ bể 3m3 nước Nhiệt độ: 250C
Sục khí liên tục
Cho ăn bằng thức ăn tổng hợp.
Thí nghiệm gây nhiễm: loài vi khuẩn có tần số xuất hiện cao được bố trí thí nghiệm cảm nhiễm. Bố trí 3 thang nồng độ cảm nhiễm lần lượt là 104, 106, 108 cfu/ml bằng cách tiêm dưới da 0.2ml dịch khuẩn/con cá. Nhóm đối chứng tiêm dưới da nước muối sinh lý tiệt trùng 0.85% 0.2ml /cá.
Chủng vi khuẩn cần nghiên cứu
Nuôi cấy tăng sinh
NaCl 0,85% Xác định mật độ VK Lô TN1 Tiêm 0.2ml dịch khuẩn 104 cfu/ml Lô TN1 Tiêm 0.2ml dịch khuẩn 108 cfu/ml Lô TN1 Tiêm 0.2ml dịch khuẩn 106 cfu/ml Lô đối chứng Tiêm 0.2ml nước muối sinh
Thí nghiệm gồm 3 bể dùng cho 3 mức nồng độ và 1 bể đối chứng. Việc lựa chọn bể cho mỗi nghiệm thức được xác định ngẫu nhiên.
Chăm sóc cá thí nghiệm: Theo dõi tình trạng sức khoẻ cá trong thời gian thí nghiệm, hàng ngày cho ăn, siphon lấy thức ăn thừa và thay 30% nước. Khi xuất hiện cá bị bệnh, ghi chép các dấu hiệu lâm sàng. Cá chết được quan sát, giải phẩu kiểm tra sự thay đổi ở những cơ quan bên ngoài và bên trong, thu mẫu bệnh phẩm để nghiên cứu vi khuẩn.
Xử lý cá bệnh sau thí nghiệm:
Cá bị bệnh ở các lô thí nghiệm được mổ phân tích vi khuẩn.
Phân lập định tính lại: Lấy mẫu bệnh phẩm gan, thận, vết loét cá bệnh phân lập định tính lại bằng test định danh vi khuẩn.
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu bệnh do nấm:
Dựa theo tài liệu của Alexopoulos (1962), Bùi Quang Tề (1995, 1997), Đỗ Thị Hoà và ctv (2003, 2004).
Hình 2.4: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu bệnh do nấm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thu mẫu
Soi tươi mẫu
Cấy mẫu
Nuôi cấy thuần
Xác định tỉ lệ cảm nhiễm
Cấy chuyển môi trường PDA
Xác định đặc điểm
hình thái, sinh sản Phân loại
Nuôi cấy trên lam kính
Vẽ hình, quan sát đặc điểm bào tử
đính Cấy sang môi
trường nghèo dinh dưỡng
2.3.3.1. Môi trường nuôi cấy nấm:
- Môi trường PDA (Patato Dextrose Agar): 3.9g/100ml.
- Môi trường nghèo dinh dưỡng APW (Autoclave Pond Water): Sử dụng nước ao đã lọc thô bằng màng lọc, lọc lại giấy lọc thấm, đổ vào bình thuỷ tinh, pha nước cất. Tỷ lệ nước ao và nước cất là: 1:2. Sau đó cho vào nồi hấp khử trùng 121oC trong thời gian 20 phút.
2.3.3.2. Phương pháp nuôi cấy và phân loại nấm:
Mẫu được đưa về phòng thí nghiệm, tiến hành kiểm tra sự nhiễm nấm bằng phương pháp soi tươi dưới kính hiển vi.
Cách xử lý: Cắt mẩu mang, vây đuôi nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên, ép la men lên, soi dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 100 & 400 lần) để kiểm tra sự nhiễm nấm.
Cấy mẫu vào môi trường PDA có bổ sung 500µm/ml kháng sinh Peniciline & Streptomycin (để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn). Lưu ý phải hơ dụng cụ cấy trên ngọn lửa đèn cồn trước khi cấy mẫu và cắt mẫu. Sau đó nuôi cấy để ở môi trường nhiệt độ 25oC, sau 2-4 ngày quan sát sự phát triển của khuẩn lạc, giống nấm sẻ được thuần loài bằng phương pháp nuôi cấy một bào tử.
Phương pháp nuôi cấy nấm thuần:
Đối với nấm bậc thấp: Từ khuẩn lạc phát triển trên môi trường PDA, ở nhiệt độ 25oC. Sau 3-4 ngày khuẩn lạc phát triển thì cắt 1 khối khoảng 0.5 cm2 nhuộm xanh malachit, soi dưới kính hiển vi thấy xuất hiện bào tử. Sau đó dùng Micropipet hút khoảng 100 µL nước nghèo dinh dưỡng APW cho vào hộp lồng có chứa các sợi nấm thu từ khuẩn lạc nấm trên, dùng que trang trang đều hộp lồng, từ hộp lồng đó hút khoảng 10 µL cấy sang đĩa môi trường PDA mới nuôi ở nhiệt độ 25oC. Khuẩn lạc phát triển trên đĩa thạch mới này được chọn là khuẩn lạc thuần loài cho thí nghiệm.
Phương pháp phân loại nấm:
Phân loại nấm: Lấy mẫu sợi nấm soi tươi hoặc nhuộm Green Malachite. Quan sát hình dạng, đặc điểm của khuẩn ty, bào tử và dựa vào tài liệu phân loại để xác định.
Phân loại nấm bậc thấp áp dụng phương pháp của G.C.Ainsworth; Frederick K. Sparrow và ctv, 1973.
Phương pháp xác định kích thước hiển vi của nấm:
Tiến hành đo kích thước: Đường kính sợi nấm, bào tử, túi bào tử…
Mỗi yếu tố tiến hành đo 30 lần, tính kích thước trung bình của mỗi yếu tố. 2.4. Phương pháp xử lý số liệu:
Phương pháp thu thập số liệu
Số liệu thứ cấp: số liệu thông qua các báo cáo của sở Nông Nghiệp, sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Lâm Đồng; các bài báo có liên quan đến đề tài nghiên cứu này.
Số liệu sơ cấp: Thời gian, số lượng cá được thu. Kích thước, khối lượng cá. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các thông số về tỷ lệ cảm nhiếm, cường độ cảm nhiễm… Xác định các thông số môi trường: nhiệt độ, pH…
Phương pháp phân tích số liệu: tổng hợp, phân tích, so sánh, rút ra các nhận xét.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nhận xét chung về hiện trạng nghề nuôi cá tầm nói riêng và nuôi cá nước lạnh nói chung tại Lâm Đồng: lạnh nói chung tại Lâm Đồng:
Lâm Đồng là tỉnh có nhiều lợi thế về đất đai, khí hậu và nguồn tài nguyên nước mát, nước lạnh (nhiệt độ dưới 180C, độ cao từ 600 m trở lên) cho phép phát triển nghề nuôi các dòng cá nước lạnh như cá tầm, cá hồi.
Hiệp hội Cá nước lạnh Lâm Đồng cho biết: Trong số 21 tỉnh phát triển nghề nuôi cá tầm, cá hồi, Lâm Đồng là tỉnh có sản lượng cao nhất nước Cả tỉnh hiện có 35 đơn vị và cá nhân được UBND tỉnh cho phép đầu tư phát triển nuôi cá nước lạnh với tổng diện tích đất theo đăng ký là 3.072 ha, trong đó có 376 ha mặt nước trực tiếp nuôi cá, và với tổng vốn đầu tư lên đến trên 1.000 tỉ đồng. Sản lượng cá nước lạnh thương phẩm trên địa bàn tỉnh tăng nhanh Năm 2007, sản lượng đạt được chỉ vào tầm 20 tấn; con số này đã tăng lên 185 tấn năm 2009; 350 tấn năm 2011 và dự kiến năm 2012, con số này không dưới 400 tấn.
Tuy nhiên, để phát triển bền vững nghề nuôi cá nước lạnh nói chung và nuôi cá tầm nói riêng, Lâm Đồng cần giải quyết những khó khăn đang gặp phải như:
Phong trào phát triển nuôi cá nước lạnh vẫn tự phát, không theo quy hoạch nên dễ dẫn đến việc gây ô nhiễm nguồn nước và dịch bệnh xảy ra là điều khó trách khỏi.
Người nuôi cá tầm còn thiếu thông tin, kiến thức về giống, hiện nay nước ta chỉ sản xuất được giống cá hồi, còn cá tầm phải nhập khẩu trứng đã thụ tinh về ấp với giá rất cao.
Bất cập thứ ba hiện nay đối với nghề nuôi cá nước lạnh chính là nguồn thức ăn. Việt Nam vẫn phải nhập khẩu thức ăn cho cá nước lạnh từ Pháp, Phần Lan …
Mặt khác, hầu hết các doanh nghiệp, trang trại nuôi cá nước lạnh chưa có dự án khả thi nên việc sản xuất còn chưa chuyên môn hóa, công nghệ khép kín chưa cao. Bên cạnh đó, việc xúc tiến thị trường, quảng bá thương hiệu, nhãn hiệu chưa được nhiều doanh nghiệp chú trọng.
Để nghề nuôi cá nước lạnh Lâm Đồng nói riêng và cá nước lạnh Việt Nam nói chung phát triển, cần tận dụng những thế mạnh và phát triển theo hướng bền vững như: hoàn thiện quy hoạch tổng thể cho từng vùng, hướng tới vùng nuôi theo tiêu
chuẩn VietGap; chủ động nguồn giống thức ăn; khai thác nghề nuôi cá nước lạnh theo các mô hình “liên kết dọc” nhằm duy trì quyền lợi, giảm thiểu rủi ro cho người nuôi. 3.2. Một số bệnh thường gặp trên cá tầm nuôi thương phẩm tại Lâm Đồng xuất
hiện trong thời gian nghiên cứu:
Trong vài năm trở lại đây phong trào nuôi cá nước lạnh đang phát triển rất nhanh, đặc biệt là ở các tỉnh miền núi, nơi có khí hậu ôn đới thuận lợi cho sự phát triển của cá. Trong đó không thể không kể đến Lâm Đồng, một trong những địa phương đi đầu về phát triển nghành nghề này, trong đó cá tầm là đối tượng đang rất được quan tâm.
Các loài cá tầm được nuôi đa số là cá tầm lai, cá tầm Nga và cá tầm Siberi. Cá sinh trưởng và phát triển tốt, ít xảy ra dịch bệnh. Cá giống cỡ 10-15cm sau 18 tháng nuôi đạt trung bình từ 3kg, con lớn nhất đạt 5-6 kg, con nhỏ nhất đạt 1,5kg. Cá được nuôi ở hai hình thức là nuôi ao tại các địa phương điển hình như: KlongKlanh, Giang Ly, Đức Trọng, Bảo Lộc, Lâm Hà trong đó tại Đức Trọng đang thử nghiệm mô hình nuôi cá tầm thương phẩm trong ao đất và trong bể xi măng 130 m3; nuôi trong lồng đặt trên các hồ: Tuyền Lâm, Di Linh, Bảo Lâm . Ao nuôi có kích thước trung bình là 500m2, sâu 2m, lồng nuôi hình tròn đường kính 12-14 m, sâu 5-6 m, mật độ thả trung bình từ 5-10 con/m3.
Nuôi trong ao nước chảy: thuận tiện ở những nơi có nguồn nước phong phú, trong sạch, nhiệt độ 18-270C. Cá được nuôi trong ao lót bạt, hoặc bê tông, cỡ giống từ 15-20 cm, sử dụng thức ăn viên hàm lượng đạm trên 43%, đa số các trại nuôi sử dụng thức ăn dành cho cá Mú của công ty UP, một số trại sử dụng thức ăn nhập từ nước ngoài về. ước tính thời gian nuôi 12 tháng cá đạt kích thước từ 2-3 kg/con, nếu nguồn nước tốt có thể đạt 30-40 tấn/ha.
Nuôi cá tầm trong lồng trên hồ chứa: lồng nuôi bằng khung gỗ hoặc khung lồng HDPE đặt ở các hồ chứa có nguồn phong phú, độ sâu trên 4m, trong sạch, độ đục >60cm, nhiệt độ 18-270C. Cỡ giống từ 100-150gam/con, nếu cá giống nhỏ hơn có thể làm thêm lồng ương giống. Nguồn nước tốt năng suất có thể đạt 30kg/1m 2 lồng.