* Kiểm tra chất lượng DNA bằng điện di agarose
Mẫu T. squamosa đƣợc tách chiết DNA bằng chelex 10% và điện di để kiểm tra
DNA tổng số
Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 1,75% để kiểm tra chất lƣợng tách chiết DNA trai tai tƣợng đƣợc thể hiện trên Hình 3.2
Hình 3.2. Kết quả điện di DNA tổng số của Tridacna squamosa
Dòng M: DNA marker 1000bp; dòng 1 – 5: DNA trai tai tƣợng
Kết quả điện di là một băng đậm nét. Qua đó cho chúng ta thấy, sản phẩm DNA cho dải dài sáng rõ, chứng tỏ việc sử dụng chelex 10% phù hợp cho việc tách chiết DNA của các loài trai tai tƣợng. Chất lƣợng DNA tách chiết tốt, hàm lƣợng DNA cao đảm bảo yêu cầu cho quá trình khuếch đại gen sau này.
* Khuếch đại trình tự
Sử dụng DNA tổng số của các cá thể trai tai tƣợng làm khuôn, cặp mồi đặc hiệu (16S, CO1-Tricro) và chu trình nhiệt nhƣ đã trình bày ở Phần 2.2.1.2, sản phẩm PCR thu đƣợc là một băng DNA duy nhất, sắc nét có kích thƣớc đúng nhƣ tính toán lý thuyết (530bp đối với gen 16S, 522bp với gen CO1)
Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR
Hình A: giếng M: marker 1500bp. Giếng 1-6: sản phẩm PCR của 16S mtDNA. Hình B: giếng M: marker 1000bp. Giếng 1-6: sản phẩm PCR của CO1 mtDNA. 3.3 Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể trai tai tƣợng
Tridacna squamosa
3.3.1 Đa dạng di truyền của Tridacna squamosa
3.3.1.1 Đa dạng di truyền của Tridacna squamosa dựa trên chỉ thị 16S
Với 19 trình tự mã hóa cho gen 16S mtDNA của T. squamosa từ 2 vùng nghiên
cứu và trình tự nhóm ngoại (T. crocea) đƣợc lấy từ Genbank, sử dụng thuật toán NJ (Neighbor joining), ML (Maximum likelihood), PM (Maximum parsimomy) để xây dựng cây phân loài dựa trên 392bp đã dóng hàng, với giá trị BT đƣợc thể hiện trên các nhánh của cây phân loài (hình 3.4)
Hinh 3.4. Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA của Tridacna squamosa thu tại vùng biển Nha Trang và Phú Quốc; Tridacna crocea là nhóm ngoại (outgroup).
Các giá trị bootstrap (phân tích NJ, ML, MP) và giá trị tin cậy (phân tích BI) đƣợc biểu hiện trên các nhánh.
Kết quả trình bày ở hình trên cho thấy các cá thể T. squamosa trong phân tích di
truyền quần thể đƣợc chia làm 2 nhóm lớn với giá trị BT tƣơng ứng trên cây phát sinh loài.
Nhóm I: gồm các cá thể T. squamosa Nha Trang và Phú Quốc với giá trị BT
trung bình (NJ 67%, ML 62%, MP 69%), ở nhánh này cho thấy mối quan hệ mật thiết giữa quần thể T. squamosa ở Phú Quốc và Nha Trang.
Nhóm II: đƣợc chia làm 2 nhóm nhỏ với giá trị BT tƣơng ứng NJ 65%, ML 63%, MP 70%, trong đó có 1 nhóm có sự phân tách riêng của các cá thể ở Nha Trang cho thấy ở khu vực này đang có những đột biến để hình thành sự phong phú của đa dạng di truyền, còn nhóm còn lại chứa các cá thể của 2 khu vực với giá trị BT là NJ 64%, ML 63%, MP 68% thể hiện mối quan hệ gần gũi về mặt di truyền của các cá thể của 2 khu vực.
19 trình tự 16S mtDNA này cũng đƣợc sử dụng để xây dựng mạng lƣới haplotype phần mềm Network và số liệu đƣợc xử lý bằng DNAsp.
Qua quan sát thấy có tổng số 9 haplotype với đa dạng haplotype tƣơng đối cao hd= 0,865 ± 0,056, đa dạng nucleotide π = 0,00423 ± 0,00052. Các thông số đƣợc trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2. Các thông số đa dạng di truyền của gen 16S mtDNA của
Tridacna squamosa Vùng thu mẫu n Tổng Số điểm đột biến số lƣợng vị trí đa hình Đa dạng di truyền Nhp hd π Nha Trang 9 7 7 7 0,944 ± 0,070 0,00624 ±0,00624 Phú Quốc 10 4 4 4 0,733 ±0,101 0,00414 ±0,00078 Nha Trang và Phú Quốc 19 8 8 9 0,865± 0,056 0,00498± 0,00061
3.3.1.2 Đa dạng di truyền của Tridacna squamosa dựa trên chỉ thị CO1 mtDNA Xây dựng cây phân loài
Xây dựng cây phân loài dựa trên 37 trình tự mã hóa cho gen CO1 mtDNA của T.
thuật toán NJ (Neighbor joining), ML (Maximum likelihood), PM (Maximum parsimomy) để xây dựng và so sánh giá trị BT ở cây phân loài dựa trên 391bp đã dóng hàng, với giá trị BT đƣợc thể hiện trên các nhánh của cây phân loài.
Hinh 3.5. Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của Tridacna squamosa
thu tại vùng biển Nha Trang và Phú Quốc; T. crocea là nhóm ngoại (outgroup). Các giá trị bootstrap (phân tích NJ/ ML/ MP) đƣợc biểu hiện trên các nhánh.
Quan sát cây phát sinh loài của T. squamosa dựa trên chỉ thị CO1 mtDNA thấy
cây phát sinh loài đƣợc chia thành 2 nhóm. Cả 2 nhóm đều xuất hiện các cá thể của Phú Quốc và Nha Trang cho thấy không có sự khác biệt rõ rệt giữa 2 vùng địa lý. Tuy
nhiên, vẫn có một số cá thể chứa các đột biến làm chúng tách ra khỏi cây phân loài nhƣng đột biến vẫn chƣa đủ để hình thành loài mới.
Haplotype network
Phân tích 37 trình tự mã hóa cho gen CO1 mtDNA của T. squamosa thu từ 2 khu vực địa lý (vịnh Nha Trang 19 trình tự, Phú Quốc 18 trình tự), qua quan sát thấy có tổng số haplotype là k=8 haplotype với đa dạng haplotype tƣơng đối thấp là hd= 0,389± 0,102, đa dạng nucleotide π = 0,00414 ± 0,00143, số lƣợng vị trí đa hình (polymorphic sites) s = 13, tổng số đột biến là 13.
Bảng 3.3. Kết quả phân tích đa dạng di truyền của Tridacna squamosa
ở Nha Trang và Phú Quốc.
Vùng thu mẫu n Đa dạng di truyền
Nhp hd π
Nha Trang 19 6 0,468±0,140 0,00467±0,00207 Phú Quốc 18 4 0,314±0,138 0,00378±0,00196 Nha Trang và
Phú Quốc 37 8 0,389± 0,102 0,00414± 0,00143
n: Số lượng các trình tự trong phân tích, Nhp: Số lượng haplotype, hd: Đa dạng haplotype, π: Đa dạng nucleotide. Số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn
Bảng 3.4. Các th ng số đa dạng di truyền của gen CO1 mtDNA của
Tridacna squamosa Số lƣợng haplotype k Đa dạng haplotype hd Đa dạng nucleotide π Tổng Số điểm đột biến số lƣợng vị trí đa hình s 8 0,389± 0,102 0,00414± 0,00143 13 13
Kích cỡ của vòng tròn thể hiện số lƣợng trình tự gen
Hình 3.6. Mạng lƣới haplotype thu từ 37 trình tự gen CO1 mtDNA của
Tridacna squamosa ở vùng biển Nha Trang và Phú Quốc.
Các đƣờng nối giữa các vòng tròn thể hiện một ƣớc đột biến. Đƣờng gạch và số thể hiện việc cộng thêm các ƣớc đột biến. Kích cỡ của vòng tròn thể hiện số
Hình 3.7. Số lƣợng và kích thƣớc haplotype ở Nha Trang và Phú Quốc.
Đa dạng di truyền trong từng khu vực thu mẫu cho thấy quần thể trai tai tƣợng thu ở Nha Trang có độ đa dạng cao hơn ở Phú Quốc. Trong tổng số 19 trình tự gen CO1 mtDNA của T. squamosa ở Nha Trang thì có 6 haplotype đƣợc quan sát với sự khác biệt trình tự 0-2,56%, còn ở Phú Quốc thì chỉ có 4 haplotype với 18 trình tự gen CO1 mtDNA, sự khác biệt trình tự là 0-2,05%. Tuy nhiên, mức độ đa dạng của các haplotype trong từng khu vực thu mẫu lại tƣơng đối cao hơn (đa dạng haplotype và đa dạng nucleotide của quần thể T. squamosa thu ở Nha trang lần lƣợt là 0,468 và 0,00467; ở Phú Quốc là 0,314và 0,00414). Qua đó có thể thấy rằng quần thể ở Nha Trang và Phú Quốc tuy có sự trao đổi gen với nhau nhƣng vẫn nhƣng vẫn có những cá thể mang nguồn gen riêng của chúng.
3.3.2 Di truyền quần thể của trai tai tƣợng (Tridacna squamosa) tại vùng biển Nha Trang và Phú Quốc
Các trình tự gen CO1 mtDNA của T. squamosa thu ở hai khu vực ven biển Việt
Nam (Nha Trang và Phú Quốc) và một số trình tự gen từ ngân hàng Gen đƣợc gióng hàng để xây dựng cây phân loài và mạng lƣới haplotype.
Kết quả phân tích mối quan hệ giữa cấu trúc di truyền quần thể trai tai tƣợng T. squamosa thu ở Nha Trang, Phú Quốc và một số vùng trong khu vực Châu Á (bao gồm
Singapore và Indo-West Pacific) đƣợc trình bày ở Hình 3.8 và mạng lƣới haplotype Hình 3.9.
Kết quả phân tích sự đa dạng loài dựa trên trình tự gen CO1 mtDNA đƣợc thực hiện bằng cách sử dụng các thuật toán NJ (Neighbor joining), ML (Maximum likelihood).
Mạng lƣới haplotype đƣợc tạo thành từ 30haplotype/73 trình tự gen CO1 mtDNA của trai tai tƣợng T. squamosa.
Hình 3.8. Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của trai tai tƣợng
Tridacna squamosa tại vùng biển Nha Trang và Phú Quốc, và một số vùng biển thuộc Châu Á; Tridacna crocea là nhóm ngoại (outgroup). Các giá trị bootstrap
Kết quả trình bày ở Hình 3.8 cho thấy, các cá thể trai tai tƣợng có trong phân tích di truyền quần thể đƣợc chia làm hai nhóm chính với giá trị BT là NJ 34% và ML 33%.
Nhóm I thể hiện mối quan hệ gần gũi giữa quần thể Nha Trang, Phú Quốc với Singapore và Indo-west pacific. Nhóm II bao gồm các quần thể Nha Trang và Phú Quốc với mối quan hệ mật thiết về di truyền.( hình 3.8)
Kích cỡ của vòng tròn thể hiện số lƣợng trình tự gen
Hình 3.9. Mạng lƣới haplotype thu từ 37 trình tự gen CO1 mtDNA của Tridacna squamosa ở vùng biển Việt Nam và Châu Á. Các đƣờng nối giữa các vòng tròn thể
hiện một ƣớc đột biến. Đƣờng gạch và số thể hiện việc cộng thêm các ƣớc đột biến. Kích cỡ của vòng tròn thể hiện số lƣợng trình tự gen. Từng màu sắc tƣơng
Nhƣ vậy, không có cấu trúc quần thể đặc trƣng cho loài trai tai tƣợng T. squamosa thu từ Nha Trang và Phú Quốc. Quần thể T. squamosa ở Nha Trang và Phú Quốc thể hiện mối quan hệ gần gũi với nhau về mặt di truyền. Đồng thời, chúng có mối quan hệ gần gũi với quần thể Singapore (hình 3.9) hơn là các quần thể T. squamosa ở các vùng Indo-west pacific và vùng Indo-West Pacific có sự đa dạng hơn rất nhiều so với vùng Nha Trang, Phú Quốc và Singapore.
Quần thể trai tai tƣợng thu ở hai khu vực khác nhau của Việt Nam đều thể hiện mối quan hệ gần gũi với quần thể loài này ở vùng ven biển Singapore, Indo-west pacific. Trong đó, quần thể trai tai tƣợng T. squamosa ở Phú Quốc thể hiện mối quan hệ tiến hóa gần gũi với quần thể Singapore hơn là các quần thể còn lại. Ngoài ra, quần thể T. squamosa ở Nha Trang và Phú Quốc đã có sự phân tách nhất định về mặt di truyền so với các quần thể của loài này ở các vùng thu mẫu khác (Hình 3.9). Tuy nhiên, cấu trúc quần thể chƣa hình thành rõ rệt.
3.3.3 Thảo luận
3.3.3.1 Đa dạng di truyền quần thể Tridacna squamosa
Tính đa dạng di truyền trong quần thể là nhân tố rất quan trọng để có thể thích nghi với những thay đổi môi trƣờng và dẫn đến sự tồn tại lâu dài và tiến hóa của loài (Đặng Thúy Bình, 2011). Do đó, xác định sự đa dạng di truyền hiện đang đƣợc coi là một mục tiêu chính trong nỗ lực bảo tồn sự đa dạng sinh học.
Tỷ lệ đa hình cao trong trình tự gen CO1 mtDNA của trai tai tƣợng bị giới hạn bởi sự di chuyển gen giữa các quần thể của loài (Kochzius M. và cộng sự, 2008).
Trong nghiên cứu hiện tại, các quần thể T. squamosa thu ở Nha Trang và Phú Quốc thể hiện tính đa dạng di truyền ở mức độ thấp với 8haplotype/37 trình tự gen CO1 mtDNA (chiếm khoảng 21,6%). Điều này có thể liên quan đến tính chất trẻ về lịch sử hình thành của vùng biển Việt Nam. Khu hệ sinh vật biển Việt Nam chỉ mới đƣợc hình thành từ sau đợt biển bị thu hẹp sau kỷ băng hà vào cuối kỷ Pleistoxen (Tạ Thị Thủy, 2011; Lê Đức Tố và cộng sự, 2003). Do đó, trong thành phần động vật thân
mềm biển Việt Nam cũng nhƣ trong các nhóm động vật biển khác, rất ít thấy hoặc hầu nhƣ chƣa có thấy các loài đặc hữu. Một số loài nhƣ trai Isocardia vulgaris, mực Sepia
harmeri, Loligo vietnamensis cũng chỉ có thể tạm thời coi là đặc hữu cho biển Việt Nam (Lê Đức Tố và cộng sự, 2003).
Theo Neo và cộng sự (2013) loài T. squamosa là loài có tập tính đẻ ở đáy nên sự
phát tán ấu trùng theo các dòng hải lƣu rất thấp, chỉ chiếm khoảng 10% so với lƣợng đƣợc sinh ra. Đây cũng là nguyên nhân dẫn đến sự đa dạng di truyền thấp của các quần thể này.
Ngoài ra, biển Việt Nam nằm trong khu vực biển Đông, tiếp giáp với vùng biển Indonesia – Malaysia ở phía nam và nhất là gần với trung tâm phát sinh, phát tán cổ xƣa và lớn nhất của sinh vật biển ven bờ vùng phía tây Thái Bình Dƣơng – vùng biển Philippine – Malaysia (Vũ Trung Tạng,Nguyễn Đình Mão, 2006; Lê Đức Tố và cộng sự, 2003).
Do đó, mức độ đa dạng di truyền trong quần thể trai tai tƣợng T. squamosa ở Việt Nam nói chung và ở Nha Trang, Phú Quốc nói riêng là không cao. Bên cạnh đó, tính đa dạng di truyền với mức độ thấp của T. squamosa còn có thể do tình trạng khai thác quá mức nguồn tài nguyên biển và sự suy thoái của môi trƣờng. Trong những năm gần đây, tình hình khai thác và xuất khẩu trai tai tƣợng nói chung và loài T. squamosa nói riêng diễn ra với qui mô lớn. Theo số liệu thống kê của CITES, từ năm 2000-2003, ở Việt Nam xuất khẩu 37004kg vỏ của T.squamosa trong khi đó T. crocea hầu nhƣ
không xuất khẩu vỏ. Ngoài ra, từ năm 2001-2003, ở Việt nam xuất khẩu khoảng 13894 cá thể T. crocea sống còn T. squamosa thì lên đến 38119 cá thể sống (theo số liệu thống kê của CITES). Thị trƣờng xuất khẩu trai tai tƣợng chủ yếu là Hoa Kỳ, Châu Âu, Nhật Bản, Hàn Quốc....(Hoàng Đình Chiều, 2009). Theo các nghiên cứu bƣớc đầu của Viện nghiên cứu Hải Sản và một số tổ chức khác, trai tai tƣợng ngoài tự nhiên của Việt Nam ngày càng cạn kiệt. Nhƣ vậy, tình trạng cạn kiệt nguồn lợi trai tai tƣợng dẫn đến
sự suy giảm nguồn gen và dẫn đến sự đa dạng di truyền thấp trong quần đàn trai tai tƣợng T. squamosa ở vùng biển ven bờ Nha Trang và Phú Quốc.
Trong nghiên cứu hiện tại cũng chỉ ra rằng, quần thể trai tai tƣợng T. squamosa ở khu vực Nha Trang có sự đa dạng hơn ở vùng ven biển Phú Quốc với 6haplotype/19 cá thể (khoảng 31,6%), sự khác biệt giữa các trình tự gen là 2,56%, trong khi ở Phú Quốc chỉ có 4haplotype/18 cá thể (22,2%) đƣợc quan sát với sự khác biệt trình tự là 0 – 2,05%.
Nguyên nhân của chênh lệch này có thể do vị trí địa lý và tính chất địa sinh học của mỗi vùng. Cả 2 vùng Nha Trang và Phú Quốc đều nằm ở các vịnh, đƣợc che chắn bở các đảo, eo biển nên ít có sự trao đổi về mặt di truyền nên cả 2 vùng đều có sự đa dạng di truyền thấp. Tuy nhiên, vịnh Nha Trang nằm trên đƣờng di chuyển của các dòng biển nóng lạnh ở khu vực biển đông nên có thể có sự trao đổi di truyền hơn vùng Phú Quốc đƣợc che chắn kín đáo bởi mũi Cà Mau và Malaysia. Do đó sự phát tán và thu nhận ấu trùng của các loài sinh vật biển từ các vùng biển khác diễn ra ít hơn so với Nha Trang.
Thêm vào đó Nha Trang có khu bảo tồn Hòn Mun đƣợc quỹ động vật hoang dã thế giới đánh giá là khu vực đa dạng sinh học biển phong phú nhất nƣớc ta, ở đây có khoảng 350 loài trong tổng số hơn 800 loài san hô cứng trên thế giới (Nguyễn Văn Hoàng, 2012) chính là nơi cƣ trú của nhiều loài sinh vật biển trong đó có T. squamosa.
Theo nghiên cứu của viện nghiên cứu hải sản năm 2012 (Trƣơng Văn Tuân và cộng sự, 2012) thì các họ trai tai tƣợng trong đó có T. squamosa phân bố chủ yếu tong vùng biển có độ mặn từ 30,7-33,9‰. Nhƣng trong nghiên cứu chất lƣợng môi trƣờng của 4 khu bảo tồn biển, trong đó có Phú Quốc thì vùng biển này có độ mặn không ổn định, dao động từ 32,5-27‰, đặc biệt độ mặn giảm mạnh vào tháng 5 đến giữa tháng 11, độ mặn thấp nhất là 27‰ ở tháng 8 (Nguyễn Công Thành, 2009), đây chính là thời gian sinh sản của loài T. squamosa. Vì vậy, tính đa dạng di truyền của các loài sinh vật
biển ở đây thấp hơn ở Nha Trang, mà cụ thể là tính đa dạng của quần thể trai tai tƣợng