Trai tai tƣợng là một trong những nguồn lợi hải đặc sản thuộc lớp động vật thân mềm hai mảnh vỏ và có giá trị kinh tế ở Việt Nam. Thịt có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, vỏ là hàng mỹ nghệ. Chúng cung cấp nguồn thức ăn bổ dƣỡng và là nguồn sản phẩm xuất khẩu mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho ngƣ dân ven biển – đảo (Nguyễn Hữu Phụng, 1995).
Cho đến nay, tại Việt Nam đã phát hiện và thống kê đƣợc tổng số 5 loài trai tai tƣợng thuộc họ Tridacnidae (trong tổng số 9 loài trên thế giới): T. gigas, T. squamosa,
T. maxima, T. crocea và H. hippopus (Nguyễn Hữu Phụng và cộng sự, 1996). Cả 5 loài
này phân bố chủ yếu ven biển miền Trung và ven các đảo phía Nam (Phú Quốc, Phú Quý, Côn Đảo, vịnh Nha Trang) từ vùng hạ triều đến độ sâu khoảng 20m, trên các nền
đáy đá hoặc các rạn san hô (Nguyễn Hữu Phụng, 1995). Ngoài ra, một số nhà khoa học cho rằng vùng biển Việt Nam có thêm cả loài T. derasa, tuy nhiên cần có những nghiên cứu phân loại dựa trên đặc điểm di truyền để có thể xác định rõ ràng hơn về loài này (Đặng Ngọc Thanh,Nguyễn Xuân Dục, 2003).
Theo tài liệu trích dẫn trong Sách Đỏ Việt Nam (2000), tại Việt Nam 2 loài trai tai tƣợng T. gigas, H. hippopus phân bố chủ yếu ở quần đảo Trƣờng Sa. Trong đó, loài trai tai tƣợng khổng lồ (T. gigas) là loài trai lớn nhất trong lớp động vật thân mềm hai mảnh vỏ. Đây là loài quý hiếm, có không gian phân bố hẹp, trữ lƣợng ngoài tự nhiên rất ít, mức đe dọa bậc R (Phùng Bảy và cộng sự, 2010).
Ngoài ra, 2 loài trai tai tƣợng là T. crocea và T. maxima đƣợc ghi nhận có phân
bố rải rác một số đảo ven biển miền Trung và phía Nam, đặc biệt loài T. crocea đƣợc tìm thấy nhiều ở Côn Đảo (Nguyễn Hữu Phụng, 1995). Trai tai tƣợng vẩy T. squamosa đƣợc ghi nhận là loài phân bố khá phổ biến ở biển Việt Nam, phân bố trên các rạn san hô từ Phú Yên, Khánh Hòa, Bình Thuận cho đến Trƣờng Sa, Phú Quý và Phú Quốc (Đỗ Công Thung,M. Sarti, 2004).
Trong những năm gần đây, nguồn lợi trai tai tƣợng ở Việt Nam đang bị khai thác quá mức khiến cho nguồn lợi này giảm sút nhanh chóng, có nguy cơ cạn kiệt. Vì vậy, để duy trì nguồn gen quý hiếm của trai tai tƣợng, tạo điều kiện thuận lợi cho chúng sinh trƣởng, phát dục, phát tán nguồn con giống trên các rạn san hô ở Côn Đảo, phòng Khoa học và Giáo dục Môi Trƣờng – Vƣờn Quốc Gia Côn Đảo đã thực hiện công tác khảo sát và di dời trai tai tƣợng từ các khu vực phân bố xa trung tâm quản lý về khoang nuôi bảo vệ tại vịnh Đầm Tre gần trạm Kiểm Lâm từ năm 2005–2007. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho trai tai tƣợng sinh trƣởng và phát triển, phục vụ cho bảo tồn, nghiên cứu khoa học và tham quan du lịch.
Năm 2006, Bùi Nhƣ Lai nghiên cứu nguồn lợi, đặc điểm sinh học, thử nghiệm sinh sản nhân tạo, đề xuất giải pháp bảo vệ, phát triển nguồn lợi trai tai tƣợng tại Côn Đảo, Bà Rịa–Vũng Tàu và bƣớc đầu đã đánh giá đƣợc sơ bộ về thành phần loài, nguồn
lợi trai tai tƣợng tại một số đảo nhỏ thuộc Vƣờn Quốc Gia Côn Đảo (Nguyễn Hữu Phụng, 1995). Ngoài ra năm 2010, Viện Nghiên cứu Hải sản đã triển khai đề tài “Nghiên cứu phục hồi và phát triển nguồn lợi trai tai tƣợng (họ Tridacnidae) ở biển
Việt Nam” (Phùng Bảy và cộng sự, 2010). Tuy nhiên, cho đến nay kết quả nghiên cứu vẫn còn nhiều hạn chế, mới chỉ dừng ở quy mô thử nghiệm và chƣa đƣợc áp dụng vào điều kiện thực tế.
Đồng thời, tại Việt Nam cho tới nay vẫn có rất ít các nghiên cứu, điều tra tổng thể về trai tai tƣợng, do đó các dữ liệu về hình thái, cấu trúc quần đàn và đặc điểm di truyền của các loài trai tai tƣợng gần nhƣ đang bị bỏ ngỏ. Với tốc độ khai thác nhƣ hiện nay, nguồn lợi loài hải sản này đang bị suy giảm nghiêm trọng. Vì vậy, các nghiên cứu chuyên sâu về trữ lƣợng, phân bố, đa dạng di truyền làm cơ sở cho công tác bảo tồn sinh vật biển là rất cấp thiết.
CHƢƠNG II: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm, thời gian, đối tƣợng nghiên cứu.
- Địa điểm thực hiện: viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng, trƣờng Đại Học Nha Trang.
- Thời gian thực hiện: từ ngày 20/02/2013 đến ngày 02/06/2013.
- Đối tƣợng nghiên cứu: trai tai tƣợng Tridacna squamosa thu tại vịnh Nha Trang (Khánh Hòa) và Phú Quốc.
Mẫu trai T. squamosa sau khi thu sẽ đƣợc đo kích thƣớc, khối lƣợng, chụp ảnh
sau đó đƣợc giữ trong nitơ lỏng hoặc cồn tuyệt đối, vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm lƣu giữ ở -70oC cho các phân tích tiếp theo.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
Các bƣớc tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền của trai tai tƣợng đƣợc thực hiện theo sơ đồ Hình 2.2
2.2.1 Phân tích đặc điểm hình thái
Các cá thể đƣợc chọn để phân tích là các cá thể đã đến tuổi trƣởng thành, đó là những cá đã thành thục sinh dục, ở độ tuổi năm thứ 6 có kích thƣớc dao động ở khoảng 16cm (Raymakers C. và cộng sự, 2003).
Mẫu trai tai tƣợng đƣợc rửa bằng nƣớc sạch, đặt lên khay đá để ráo nƣớc. Dùng thƣớc có chia độ đo (cm và mm) để đo các kích thƣớc của vỏ trai (Hình 2.2).
Chiều dài vỏ đƣợc đo từ mép vỏ mặt sau đến mép vỏ mặt trƣớc. Chiều cao vỏ đo từ mép vỏ phía mặt lƣng đến đỉnh vỏ phía mặt bụng. Chiều rộng vỏ là khoảng rộng nhất giữa hai vỏ khi chúng khép chặt. Chiều dài bản lề đo từ đỉnh vỏ đến mép vỏ, nơi hai mảnh vỏ đóng mở. Chiều dài lỗ tơ chân đo từ đỉnh vỏ đến hết chiều dài lỗ tơ chân.
Mẫu trai
Mô tả đặcđiểm hình thái
Tách chiết DNA tổng
Khuếch đại gen 16S và CO1 mtDNA Cặp mồi 16S và CO1 Trico Điện di 80V, 20 phút Giải trình tự gen
Xây dựng cây phân loài Chelex 10%
Hình 2.2 Đo kích thƣớc của trai tai tƣợng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(Lv chiều dài vỏ, Wv chiều rộng vỏ,LBLchiều dài bản lề, LLTCchiều dài lỗ tơ chân,
WLTchiều rộng lỗ tơ chân)
Dùng cân kỹ thuật để cân khối lƣợng từng mẫu, chụp ảnh và quan sát nếp gấp, đƣờng viền, hình dạng vỏ, màu sắc và hoa văn. Trai tai tƣợng đƣợc định danh dựa vào đặc điểm hình thái theo Rosewater (1982) (1965) và Lucas (1988).
2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu di truyền
2.2.2.1 Tách chiết DNA, PCR, giải trình tự * Tách chiết DNA * Tách chiết DNA
* Lựa chọn vị trí lấy mẫu mô tách chiết DNA
Mẫu mô nghiên cứu quyết định trực tiếp chất lƣợng DNA và sự thành công của phản ứng khuếch đại gen. Do vậy, việc lựa chọn mẫu trai và vị trí lấy mẫu đóng một vai trò vô cùng quan trọng.
Đối với trai tai tƣợng, DNA có thể tách chiết từ nhiều vị trí khác nhau nhƣ mô cơ chân, mô cơ khép, màng áo. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này thì tiến hành tách chiết DNA tổng số tại mô cơ để có kết quả tách chiết DNA tốt vì tại vị trí này, mô cơ thịt có màu trắng trong, không bị lẫn tạp chất từ các cơ quan tiêu hóa hay tảo cộng sinh ở màng áo nên quá trình tách chiết đƣợc dễ dàng hơn.
DNA đƣợc tách chiết từ mẩu cơ của từng cá thể T. squamosa bằng chelex 10% theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Bƣớc 1: Cắt một miếng nhỏ cơ của T. squamosa cho vào tuyp đã chứa sẵn 300µl chelex 10%
Bƣớc 2: Ủ mẩu qua đêm trong bể ổn nhiệt, ở nhiệt độ 95o C. Bƣớc 3: Votex và li tâm 5000 vòng trong 5 phút.
*Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
2 μL dung dịch tách chiết DNA đƣợc dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn gen 16S mtDNA (16S mitochondrial DNA), CO1 mtDNA (Cytochrome oxidase c subunit 1 mitochrondrial DNA).
Bảng 2.1. Trình tự các đoạn mồi:
Gen Mồi xuôi Mồi ngƣợc Nguồn
16S mtDNA 16SF-5’-CCGGTCTG AACTCAGATCACGT-3’ 16SR-5’-GTTTACCAAAA ACATGGCTTC-3' Espiritu và cs, 2001 CO1 mtDNA 5’GGGTGATAAT TCGAACAGAA-3’ 5’-TAGTTAAAGCC CCAGCTAAA-3’ Kochzius và cs, 2008 Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với tổng thể tích là 25µl trong đó bao gồm 2µl khuôn DNA; 2,5µl Dream taq buffer 1X; 0.5 mM dNTP; 1µl mỗi mồi; 0,125µl taq và nƣớc cho đủ thể tích. Phản ứng đƣợc chạy theo chƣơng trình nhiệt độ :
Gen 16S mtDNA: Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ của 94oC trong 40 giây, 47oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây, cuối cùng là bƣớc kéo dài tại 72oC trong 5 phút.
Gen CO1 mtDNA: Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ của 94oC trong 1 phút, 43oC trong 1 phút 30 giây, 72oC trong 1 phút, cuối cùng là bƣớc kéo dài tại 72oC trong 5 phút.
Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,75% nhuộm ethidium bromide.
Các bước tiến hành
Chuẩn bị gel agarose 1,75% : Cho 0,7 g agarose vao 40ml đệm SB 10X, đem đi
đun trên bếp cách thủy hoặc lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn, hạn chế bay hơi nƣớc để tránh tăng nồng độ agarose. Để nguội khoảng 60oC thì lấy 1,5µl ethidium bromide cho vào trộn đều với gel, sau đó đổ dung dịch agarose vào khuôn gel điện di đã cài sẵn lƣợc (8 giếng hoặc 15 giếng). Sau 25-30 phút, khi gel đã động cứng thì tháo lƣợc ra, cho gel vào máy điện di đổ đệm SB ngập khuôn cách mặt gel từ 1-2mm.
Tra mẫu DNA vào giếng điện di
Lấy 4µl sản phẩm PCR trộn chung với 1µl loading buffer sau đó tra vào giếng nhỏ trên gel.
Chạy điện di cùng với DNA chuẩn (Marker) để xác định kích thƣớc phân tử DNA.
Chạy điện di: U= 80-90V, I= 400mA, trong thời gian 20 phút. Phân tử DNA sẽ di
chuyển từ cực âm sang cực dƣơng.
Đọc kết quả và chụp hình :
Sau khi chạy xong (khi thấy vệt màu xanh cách giếng khoảng 3cm) lấy khuôn ra khỏi máng và đặt gel lên bàn UV của máy Gel Doc (Bio-rad).
Xem các dải DNA dƣới tia sáng của đèn cực tím. Kết quả sẽ đƣợc ghi nhận thông qua phần mềm Quantity One. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Giải trình tự
Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng điện di sẽ đƣợc gởi cho công ty TNHH thƣơng mại sản xuất và dịch vụ Nam Khoa, 793/58 Trần Xuân Soạn. Phƣờng Tân Hƣng, Quận 7, thành phố Hồ Chí Minh.
2.2.2.2 Phân tích đa dạng loài trai tai tƣợng * Kết nối trình tự * Kết nối trình tự
Các trình tự trai tai tƣợng thu đƣợc sẽ đƣợc kết nối bằng kỹ thuật Contig Express trong phần mềm Sequencher 4.1.4 và kiểm tra lại bằng mắt (Kochzius M. và cộng sự, 2008).
Sau đó, các trình tự đó sẽ đƣợc kiểm chứng bằng chƣơng trình Blast Nucleotide trên webside của ngân hàng Gen (ncbi.nlm.nih.gov/Blast/). Các trình tự đƣợc gióng hàng bằng phần mềm Mega5 (Hall B. G., 2013) và đƣợc kiểm tra lại và chỉnh sửa bằng mắt thƣờng.
* So sánh trình tự của trai tai tƣợng
Sự khác biệt di truyền của các cặp trình tự của các loài cần so sánh đƣợc tính toán theo công thức:
* Phân tích đa dạng loài trai tai tƣợng Tridacna quamosa dựa trên haplotype
Đa dạng di truyền (Genetic diversity) giữa các quần thể trai đƣợc tính bằng tổng số haplotype (k), số lƣợng vị trí đa hình – polymorphic sites (s), đa dạng haplotype – haplotype diversity (hd) và đa dạng nucleotide – nucleotide diversity (Π), số đột biến (η).
Tổng số hapotype:
Haplotype là một biến thể thứ tự duy nhất của một gen tại cùng một locus trong bộ gen. Các trình tự gen có cũng số điểm đột biến lập thành một haplotype. Các haplotype khác nhau bởi một điểm đột biến
Đa dạng haplotype: xác suất hai lựa chọn ngẫu nhiên các haplotype trong một mẫu là khác nhau (tƣơng đƣơng với dị hợp tử đƣợc mong đợi )
h = (1- 2i)
*100% Sự khác biệt di truyền =
Số Nucleotide khác biệt
Trong đó: h là đa dạng haplotype
n là số lƣợng các haplotype trong một mẫu
p là tần số của từng haplotype trong mẫu
Đa dạng nucleotide: là số lƣợng trung bình của các vị trí nucleotide khác nhau giữa hai chuỗi nucleotide đƣợc rút ra ngẫu nhiên từ một mẫu
Cách tính: Số lƣợng trung bình của các vị trí nucleotide khác nhau giữa hai chuỗi
đƣợc rút ra một cách ngẫu nhiên từ một mẫu:
Trong đó, xi, xj là tần số của các alen i và j; πij là tần suất sai khác giữa alen i và j; n là chiều dài của chuỗi nucleotide.
Số đột biến:
Xác suất mà bất kỳ một vị trí nào xảy ra đột biến là:
Xác suất đột biến = số đột biến/tổng số nucleotide trong chuỗi/thế hệ Tổng số đột biến trên cả chiều dài chuỗi nucleotide là:
η = xác suất đột biến * (tổng số nucleotide – số nucleotide đã bị đột biến).
Phần mềm Network4.6.1 đƣợc xử dụng để xây dựng mạng lƣới haplotype với các trình tự đƣợc dóng hàng bởi Mega5.05 và các số liệu đƣợc xử lý bằng DNAsp5
2.2.2.3 Phân tích đa dạng trai tai tƣợng Tridacna squamosa
Phân tích đa dạng trai tai tƣợng T. squamosa đƣợc thực hiện dựa trên tập hợp
trình tự gen CO1 mtDNA của nó đƣợc thu ở vịnh Nha Trang (Nha Trang-Khánh Hòa) và Phú Quốc (Kiên Giang) và các trình tự gen trên Genbank, cụ thể nhƣ sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các trình tự CO1 mtDNA:
19 trình tự ở vịnh Nha Trang và 18 trình tự ở Phú Quốc trong nghiên cứu hiện tại. 36 trình tự từ Genbank của loài Tridacna squamosa ở 2 địa điểm thu mẫu : Indo-West Pacific -18 trình tự, Singapore - 18 trình tự.
Thông tin về các trình tự, mã số gen của T. squamosa sử dụng trong nghiên cứu đƣợc trình bày ở Bảng 2 phần phụ lục bảng
Các trình tự 16S mtDNA:
9 trình tự ở vịnh Nha Trang và 10 trình tự ở Phú Quốc trong nghiên cứu hiện tại. 11 trình tự từ Genbank của loài T. squamosa ở 2 địa điểm thu mẫu: the Coral
Triangle 1 trình tự và Biển Đỏ 10 trình tự.
1 trình tự từ Genbank làm nhóm ngoại : trình tự loài T. crocea. Thông tin về trình tự đƣợc trình bày ở Bảng 2 phần phụ lục bảng
Phương pháp phân tích cây tiến hóa
Phân tích đa dạng di truyền của loài T.squamosa đƣợc tiến hành dựa trên 3 thuật toán Maximum parsimony (MP), Neighbor joining (NJ) và Maximum likelihood (ML), các phƣơng pháp đƣợc phân tích bằng các phần mềm MEGA 5.10 (Hall B. G., 2013), Dnasp5 (Librado P.,Rozas J., 2009) và Network (Bandelt H. J. và cộng sự, 1999). Giá trị bootstrap (BT) đƣợc tính toán để xác định tính chính xác của thuật toán MP, ML và NJ với độ lặp lại 1000.
Xây dựng mạng lưới haplotype- haplotype network
Việc xây dựng các lƣới haplotype đƣợc sử dụng để trình bày sự liên kết giữa các haplotype. Đây là cách sắp xếp các haplotype thu đƣợc từ một mẫu nghiên cứu một cách tối ƣu và đơn giản. Việc này không chỉ tiết kiệm thời gian mà còn thuận tiện trong việc xem xét mối quan hệ giữa các haplotype.
Để xây dựng mạng lƣới haplotype, sử dụng phần mềm Network 4.6.1 (Bandelt H. J. và cộng sự, 1999). Phần mềm này sử dụng kết nối mạng dữ liệu đầu vào đƣợc tạo ra phần mềm DnaSPv5 và sử dụng thuật toán Median Joining (chức năng Calculate Network) để tính, chức năng Draw network cho phép tự động vẽ ra mạng lƣới giữa các haplotype đƣợc xem xét.
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Đặc điểm hình thái của Tridacna squamosa ở Nha Trang và Phú Quốc. 3.1.1 Đặc điểm hình thái 3.1.1 Đặc điểm hình thái
Trai tai tƣợng T. squamosa thu ở Nha Trang và Phú Quốc có kích thƣớc trung
bình so với các loài khác thuộc họ Tridacnidae. Chiều dài vỏ đạt từ 15-17,5cm (trung bình đạt 16,23cm), khối lƣợng của mẫu nghiên cứu thu đƣợc dao động từ 540 – 750g (trung bình đạt 623,78 g). Kích thƣớc và khối lƣợng này tùy thuộc vào từng giai đoạn sinh trƣởng của các cá thể (bảng 3.1).
Vỏ lớn, dày chắc, nặng, hình trứng. Hai vỏ bằng nhau, mép bụng vỏ cong gợn sóng, trƣớc đỉnh vỏ có lỗ tơ chân nhỏ. Bản lề ngoài dài màu nâu, mặt vỏ màu trắng đục, có 4-6 gờ phóng xạ rất lớn, trên đó có nhiều phiến vảy phóng xạ nhô cao. Mƣơng giữa 2 gờ phóng xạ lớn, có nhiều gờ phóng xạ nhỏ. Mặt trong vỏ màu trắng sứ, mép lỗ tơ chân có một số gờ cắt ngang, dạng răng cƣa. Màng áo có các đƣờng vân chạy song song với nhiều màu sắc khác nhau (hình 3.1)
Bảng 3.1. Các th ng số đo đạc kích thƣớc của Tridacna squamosa