* Tách chiết DNA
* Lựa chọn vị trí lấy mẫu mô tách chiết DNA
Mẫu mô nghiên cứu quyết định trực tiếp chất lƣợng DNA và sự thành công của phản ứng khuếch đại gen. Do vậy, việc lựa chọn mẫu trai và vị trí lấy mẫu đóng một vai trò vô cùng quan trọng.
Đối với trai tai tƣợng, DNA có thể tách chiết từ nhiều vị trí khác nhau nhƣ mô cơ chân, mô cơ khép, màng áo. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này thì tiến hành tách chiết DNA tổng số tại mô cơ để có kết quả tách chiết DNA tốt vì tại vị trí này, mô cơ thịt có màu trắng trong, không bị lẫn tạp chất từ các cơ quan tiêu hóa hay tảo cộng sinh ở màng áo nên quá trình tách chiết đƣợc dễ dàng hơn.
DNA đƣợc tách chiết từ mẩu cơ của từng cá thể T. squamosa bằng chelex 10% theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Bƣớc 1: Cắt một miếng nhỏ cơ của T. squamosa cho vào tuyp đã chứa sẵn 300µl chelex 10%
Bƣớc 2: Ủ mẩu qua đêm trong bể ổn nhiệt, ở nhiệt độ 95o C. Bƣớc 3: Votex và li tâm 5000 vòng trong 5 phút.
*Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
2 μL dung dịch tách chiết DNA đƣợc dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn gen 16S mtDNA (16S mitochondrial DNA), CO1 mtDNA (Cytochrome oxidase c subunit 1 mitochrondrial DNA).
Bảng 2.1. Trình tự các đoạn mồi:
Gen Mồi xuôi Mồi ngƣợc Nguồn
16S mtDNA 16SF-5’-CCGGTCTG AACTCAGATCACGT-3’ 16SR-5’-GTTTACCAAAA ACATGGCTTC-3' Espiritu và cs, 2001 CO1 mtDNA 5’GGGTGATAAT TCGAACAGAA-3’ 5’-TAGTTAAAGCC CCAGCTAAA-3’ Kochzius và cs, 2008 Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với tổng thể tích là 25µl trong đó bao gồm 2µl khuôn DNA; 2,5µl Dream taq buffer 1X; 0.5 mM dNTP; 1µl mỗi mồi; 0,125µl taq và nƣớc cho đủ thể tích. Phản ứng đƣợc chạy theo chƣơng trình nhiệt độ :
Gen 16S mtDNA: Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ của 94oC trong 40 giây, 47oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây, cuối cùng là bƣớc kéo dài tại 72oC trong 5 phút.
Gen CO1 mtDNA: Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ của 94oC trong 1 phút, 43oC trong 1 phút 30 giây, 72oC trong 1 phút, cuối cùng là bƣớc kéo dài tại 72oC trong 5 phút.
Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,75% nhuộm ethidium bromide.
Các bước tiến hành
Chuẩn bị gel agarose 1,75% : Cho 0,7 g agarose vao 40ml đệm SB 10X, đem đi
đun trên bếp cách thủy hoặc lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn, hạn chế bay hơi nƣớc để tránh tăng nồng độ agarose. Để nguội khoảng 60oC thì lấy 1,5µl ethidium bromide cho vào trộn đều với gel, sau đó đổ dung dịch agarose vào khuôn gel điện di đã cài sẵn lƣợc (8 giếng hoặc 15 giếng). Sau 25-30 phút, khi gel đã động cứng thì tháo lƣợc ra, cho gel vào máy điện di đổ đệm SB ngập khuôn cách mặt gel từ 1-2mm.
Tra mẫu DNA vào giếng điện di
Lấy 4µl sản phẩm PCR trộn chung với 1µl loading buffer sau đó tra vào giếng nhỏ trên gel.
Chạy điện di cùng với DNA chuẩn (Marker) để xác định kích thƣớc phân tử DNA.
Chạy điện di: U= 80-90V, I= 400mA, trong thời gian 20 phút. Phân tử DNA sẽ di
chuyển từ cực âm sang cực dƣơng.
Đọc kết quả và chụp hình :
Sau khi chạy xong (khi thấy vệt màu xanh cách giếng khoảng 3cm) lấy khuôn ra khỏi máng và đặt gel lên bàn UV của máy Gel Doc (Bio-rad).
Xem các dải DNA dƣới tia sáng của đèn cực tím. Kết quả sẽ đƣợc ghi nhận thông qua phần mềm Quantity One.
* Giải trình tự
Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng điện di sẽ đƣợc gởi cho công ty TNHH thƣơng mại sản xuất và dịch vụ Nam Khoa, 793/58 Trần Xuân Soạn. Phƣờng Tân Hƣng, Quận 7, thành phố Hồ Chí Minh.