A. CÁ KOI
4.2.1.3.Kết quả phân lập SVCV và KHV
Qua 15 đợt thu mẫu khi cá bị bệnh, với biểu hiện tưa đuơi, vây, loét gốc đuơi, mang hoại tử, xuất huyết các gốc vây và cĩ dịch vàng trong xoang bụng bao gồm 118 mẫu, khơng quan sát thấy CPE do nhiễm SVCV và KHV trên tế bào.
ðối với mẫu cá koi cĩ biểu hiện bình thường được thu ngẫu nhiên theo tỷ lệ trên quần đàn của các trại ở tại các quận, huyện gồm Củ Chi, Hĩc Mơn, quận 12 và Quận 9 tổng cộng 237 mẫu đủ kích cỡ từ cá giống đến cá bố mẹ trong 2 đợt tháng 7 và tháng 12 năm 2007 đều cho kết quả âm tính cả 2 loại virus SVC và virus KHV.
4.2.2. Kết quả phân lập vi khuẩn
Mẫu được thu vào thời điểm cá bệnh. Tất cả các mẫu được thu từ cá bệnh sau khi chuyển lên bể 3-5 ngày. Cá cĩ hiện tượng nằm đáy, bơi lờđờ, thân xuất huyết hoặc khơng, mang hoại tử nặng, các sợi mang cĩ tiết nhiều nhớt và dính lại. Quan sát nội tạng cho thấy thận và lách bình thường, một số trường hợp lách bị sưng. Mẫu kiểm tra vi khuẩn được lấy trực tiếp từ gan, thận và mang.
Flexibacter columaris cĩ hình dạng khác biệt so với các loại vi khuẩn khác: dài, mảnh, khơng roi, chuyển động theo dạng trượt. Theo Sniesco (1981), việc chẩn
đốn vi khuẩn này cĩ thể dựa vào việc quan sát vi khuẩn từ vết phiết tươi mẫu mang hoặc các kỹ thuật nhuộm khác, đồng thời, do F. columnaris khơng mọc trên mơi trường dinh dưỡng thường sử dụng cho nuơi cấy vi khuẩn (thạch máu, BHIA) vì vậy kỹ thuật soi tươi và nhuộm Giemsa được sử dụng để xác định sự hiện diện của vi khuẩn này.
Những trường hợp cá bị bệnh cĩ biểu hiện đặc trưng, vi khuẩn sợi quan sát thấy rất nhiều trên mẫu soi tươi của mang và nhớt, tuy nhiên mật độ vi khuẩn ở dịch nhớt thường thấp hơn mang. Khơng thấy cĩ sự hiện diện của vi khuẩn này trên lách và thận. Vi khuẩn cĩ dạng sợi rất mảnh, kích thước chiều dài 4- 5µm, khơng roi, di động bằng cách trượt.
Bảng 2: Kết quả phân tích vi khuẩn trên cá Koi
Vi khuẩn Số mẫu nhiễm/ tổng số mẫu Tỷ lệ (%) F. columnaris 40/40 100 A. hydrophila 46/52 90 A. caviae 1/52 1,9 A. sobria 1/52 1,9 Aeromonas sp. 5/52 9,6 A. veroni 2/52 3,8 Vibrio cholerae 3/52 5,7
F. columnaris gây bệnh ở bện ngồi, trên mang, vây và da, khơng thấy sự hiện diện của vi khuẩn trên các cơ quan nội tạng (thận. lách).
Bảng 3: Kết quả phân tích F. columnaris bằng kỹ thuật nhuộm Giemsa
Loại mẫu Mẫu nhiễm F. columnaris/ tổng số mẫu Tỷ lệ (%) Mang 40/40 100 Nhớt 7/9 77,7 Lách 0/20 0 Thận 0/20 0
Do vi khuẩn khĩ mọc trên mơi trường rắn, thậm chí kể cả mơi trường chuyên biệt Cytophaga, do đĩ F. columnaris được nuơi trong mơi trường lỏng L-15, bổ sung 10% FBS. Vi khuẩn mọc chậm, thường dính chùm hoặc thành chuỗi.
Hình 10: Vi khuẩn F. columnaris, nuơi
trong mơi trường lỏng L-15-FBS.
Hình 11: Vết phiết mang của cá bệnh, nhiều vi khuẩn sợi, nhuộm Giemsa, 1000X.
Khi quan sát mẫu mơ học của mang cho thấy các tơ mang bị hoại tử nặng.
Hình 12: Mang cá bệnh bị phân hủy
F. columnaris là vi khuẩn cĩ khả năng tiết ra enzyme phân giải protein, vì vậy khi xâm nhiễm vào mang và thân, vi khuẩn gây cho mang bị thối rữa hoặc hoại cơ, làm cá khơng hơ hấp được nên thường nổi lờ đờ trên mặt nước hoặc các vùng cĩ nhiều khơng khí (Sanna và cs., 2002). Trên thân khi bị nhiễm vi khuẩn nặng sẽ xảy ra hiện tượng thối đuơi, mịn vây đồng thời kèm theo các biểu hiện xuất huyết. Vi khuẩn đặc biệt phát triển mạnh trong điều kiện nuơi kém hoặc thức ăn dư thừa làm ơ nhiễm nước, nồng độ nitrite cao, hoặc khi nuơi với mật độ cao, nồng độ oxy hịa tan thấp.
Hình 13: Cá Koi xuất huyết các vây, hoại tử
gốc vây đuơi.
Hình 14: Mang cá Koi bị hoại tử, vây đuơi bị xuất huyết, ăn mịn.
Hình 15: Mang tưa - Cá Koi Hình 16: Mang cá chép bị xuất huyết, tiết nhớt, các sợi mang dính lại
Qua quan sát vết phiết tươi mẫu mang cho thấy 100% (40/40 mẫu) cá cĩ nhiễm vi khuẩn sợi trên mang. ðồng thời tần xuất bắt gặp A. hydrophila trên các mẫu cấy từ
mang và vết loét khá cao, trên tổng số 52 mẫu cá bệnh phân lập được vi khuẩn A. hydrophila với tỷ lệ cao nhất 90% (46/52 mẫu), kế tiếp là vi khuẩn Aeromonas sp.
9,6% (5/52 mẫu). Ngồi ra cịn một số chủng khác như V. cholerae 5,7% (3/52
mẫu), Aeromonas veroni 3,8% (2/52 mẫu), và thấp nhất với tỷ lệ 1,9% (1/52 mẫu)
đối với các vi khuẩn Aeromonas caviae, Aeromonas sobria.
Flexibacter sp. được biết đến là vi khuẩn gây bệnh trên mang (hay cịn gọi là bệnh trụ, bệnh columnaris). Bệnh lần đầu tiên được cơng bố bởi Davis vào năm 1922 và
được xem là một trong những bệnh vi khuẩn phổ biến nhất trên cá nước ngọt. Bệnh xảy ra trên cá nheo, cá vàng và cá chép Koi. Năm 1944, Ordal và Rucker lần
trong những trường hợp mơi trường bị thay đổi như nhiệt độ cao (> 200C), mật độ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nuơi cao, chất lượng nước kém, hàm lượng nitrite cao hoặc khi lượng chất hữu cơ
dư thừa trong nước cao, hàm lượng muối trong nước cao sẽ làm tăng độc lực của vi khuẩn dẫn đến cá bị bệnh và chết với tỷ lệ cao.
4.2.3. Kết quả phân tích ký sinh trùng
Các mẫu cá được kiểm tra ký sinh trùng trên mang, nhớt thân, vây, ruột. Phần lớn các ký sinh trùng quan sát được là sán lá đơn chủ, ngồi ra cịn cĩ trùng bánh xe ký sinh nhiều trên thân.
Bảng 4: Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá Koi
Cường độ nhiễm STT Tên ký sinh trùng ðợt Cơ quan ký sinh Tỉ lệ
nhiễm % Min-max Trung bình
1 Gyrodactylus sp. ðợt 2 Mang 100 2-121 64,5 Mang 66,67 11-70 25,0 ðợt 3 Nhớt thân 33,33 1-1 0.33 ðợt 4 Mang 100 6-14 8,80 ðợt 5 Mang 100 2-117 32,5 ðợt 6 Mang 100 2-22 10,1 ðợt 11 Mang 50 1-2 0,47 2 Dactylogyrus extensus ðợt 12 Mang 8,33 2-200 16,67 Nhớt thân 20 0-6 1,20 ðợt 4 Vây 20 0-6 1,20 Nhớt thân 100 30-431 117,37 Vây 100 12-194 56,17 3 Trichodina multibilis ðợt 5 Mang 100 2-8 3,0 4 Trichodina nobilis ðợt 3 Nhớt thân 33,33 0-1 0,33 ðợt 5 Mang 16,67 0-8 1,33 5 Centrocestus formasanus ðợt 11 Mang 16,67 0-1 0,10 ðợt 3 Mang 33,33 0-2 0,67 6 Ichthyoph sp. ðợt 4 Vây 40 2-4 1,20
Trong các mẫu phân tích, Dactylogyrus extensus cĩ tần số xuất hiện nhiều nhất ở
6/12 đợt thu mẫu với cường độ nhiễm trung bình cao nhất 32,5 sán/cung mang.
Gyrodactylus sp. ký sinh trên mang với cường độ nhiễm trung bình cao hơn (64,50 sán/cung mang), tuy nhiên tần xuất bắt gặp ký sinh trùng này thấp (1/12 đợt).
Ngồi ra cịn cĩ Centrocestus formasanus với cường độ nhiễm trung bình 1,33 sán/ cung mang. Trên nhớt thân, Trichodina multibilis hiện diện với cường độ
nhiễm trung bình cao nhất 117,37 trùng/ thị trường, Trichodina nobilis 0,33
trùng/thị trường và Ichthyophthirius sp. 1,20 trùng/thị trường. Tuy nhiên với cường độ nhiễm thấp, các loại ký sinh trùng này khơng cĩ khả năng gây chết cá
Gyrodactylus sp. Dactylogyrus extensus
Centrocestus formasanus
Trichodina multibilis Trichodina nobilis
Ngồi ra, kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá koi vào 2 đợt: tháng 12 năm 2007 và tháng 4 năm 2008 cho thấy cĩ sự hiện diện của bào tử trùng 2 cực nang
Myxobolus sp., Henneguya sp. ký sinh trên mang cá với tỷ lệ khoảng 13%.
Bảng 5: Kết quả kiểm tra bào tử trùng trên cá Koi
ðợt Ký sinh trùng Tỷ lệ nhiễm Cường độ nhiễm
Myxobolus sp. 12/2007 Henneguya sp. 20/145 (13%) + đến ++ Myxobolus sp. + đến +++ 4/2008 Henneguya sp. 10/80 (12,5%)
Hình 18: Cá nhiễm bào tử trùng Hình 19: Bào tử trùng 2 cực nang
Bào tử trùng là tác nhân gây bệnh khá nguy hiểm trên cá nước ngọt, mặc dù khơng gây chết khi cá nhiễm ở cường độ thấp nhưng bào nang nhờ cĩ vách rất dày nên cĩ thể tồn tại rất lâu trong mơi trường nuơi và cĩ thể chống chọi với các thuốc, hĩa chất. Vì vậy việc chữa trị khi bị nhiễm bào tử trùng trên cá tỏ ra khơng hiệu quả.
4. 3. Cảm nhiễm ngược
F. columnaris đã được biết đến là tác nhân gây bệnh trên mang cá Koi. Vì vậy việc cảm nhiễm vi khuẩn sợi trên cá khơng được thực hiện.
Tuy nhiên, kết quả phân lập ngồi F. columnaris cịn cĩ sự hiện diện của A. hydrophila với tần xuất khá cao, do đĩ việc cảm nhiễm được tiến hành đối với chủng vi khuẩn này để hiểu thêm về khả năng gây bệnh của A. hydrophila trên cá
Koi.
*Thí nghiệm 1: Gây nhiễm vi khuẩn A. hydrophila với các mật độ vi khuẩn khác nhau vào cá Koi cĩtrọng lượng cá 10 gram. Gây nhiễm bằng hai phương pháp: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phương pháp ngâm: ngâm vi khuẩn vào cá, liều gây nhiễm 106 tế
bào/ml nước
- Phương pháp tiêm: tiêm xoang bụng, thể tích tiêm 1% trọng lượng cơ thể cá.
Gây nhiễm vi khuẩn A. hydrophila vào cá bằng phương pháp ngâm tỏ ra khơng hiệu quả. Cá khơng biểu hiện bệnh sau 7 ngày theo dõi. Tuy nhiên cá chết nhiều khi gây nhiễm vi khuẩn bằng cách tiêm xoang bụng.
Bảng 6: Kết quả gây nhiễm thăm dị vi khuẩn A. hydrophila trên cá Koi
Tổn tích lũy cá chết (con) / Thời gian (ngày) Vi khuẩn 0,1 ml Tiêm xoang bụng 1 2 3 … 14 Ghi chú ðối chứng NaCl 0,85% N=14 0 0 0 … 0 Cá bình thường A. hydrophila 106 tế bào/ml N=8 0 0 0 … 0 Cá bình thường A. hydrophila 107 tế bào/ml N=14 0 0 0 … 0 Cá bình thường A. hydrophila 108 tế bào/ml N=14 7 12 12 … 12 2 con biểu hiện lờđờ A. hydrophila 109 tế bào/ml N=14 14 14 14 … 14 Cá bị bầm tím từ mặt bụng đến hầu
Nhận xét: Cá ở lơ tiêm nồng độ 106 tế bào/ml và 107 tế bào/ml vẫn bình thường sau 2 tuần gây nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và cũng khơng biểu hiện bệnh điều này cĩ thể do nồng độ vi khuẩn chưa đủ mạnh để gây bệnh. Ở lơ 108 tế bào/ml cá chết cấp tính 7/14 con sau 1 ngày gây nhiễm và 5/14 vào ngày tiếp theo, nhưng từ
ngày thứ 3 trở đi cá khơng chết mà chỉ biểu hiện lờ đờ, bỏ ăn. Tuy nhiên cá dần phục hồi trở lại sau 1 thời gian. Cịn ở lơ 109 tế bào/ml cá bị chết cấp tính 100% sau 15 giờ gây nhiễm. ðiều này cho thấy vi khuẩn A. hydrophila gây nhiễm trên cá với liều cao cĩ thể gây chết cấp tính trên cá Koi. Khi bị nhiễm vi khuẩn ở liều thấp, cá bị yếu đi và khỏe trở lại sau vài ngày.
Từ kết quả trên liều gây nhiễm A. hydrophila dãy nồng độ 108 tế bào/ml được áp dụng gây nhiễm lên cá Koi để theo dõi sự phát sinh bệnh của cá khi bị xâm nhiễm bởi A. hydrophila.
*Thí nghiệm 2: Gây nhiễm vi khuẩn A. hydrophila ở các liều gây nhiễm khác nhau
Bảng 7: Kết quả gây nhiễm vi khuẩn A. hydrophila ở các liều gây nhiễm khác nhau Tổng tích lũy cá chết (con)/ Thời gian (ngày) Vi khuẩn 0,1 ml Tiêm xoang bụng 1 2 3 … 21 Ghi chú ðối chứng NaCl 0,85% n=7 0 0 0 … 0 Cá bình thường A. hydrophila 3 x 108 tế bào/ml n=7 0 0 0 … 0 1 con cá bị loét nhẹ ở màng bụng A. hydrophila 6 x 108 tế bào/ml n=6 0 0 0 … 0 1 con cá bị lĩet nặng và 5 con cá lĩet nhẹ ở màng bụng A. hydrophila 9 x 108 tế bào/ml n=7 3 0 0 … 0 4 con cá cịn lại bị lĩet nặng ở màng bụng
Nhận xét: Ở liều gây nhiễm 3 x 108 tế bào/ml và 6 x 108 tế bào/ml, tiêm 0,1ml cho mỗi cá thể, cá cĩ biểu hiện lĩet nhẹở màng bụng xung quanh vết tiêm. Cịn ở mật
độ vi khuẩn 9 x 108 tế bào/ml cá bị chết cấp tính 3/7 con sau 18h gây nhiễm, những con cá cịn lại bị lĩet ở màng bụng và tự lành vết thương sau 3 tuần nuơi. Như vậy cá Koi nhiễm vi khuẩn A. hydrophila ở mật độ cao bị lở loét ở những vùng tổn thương và sẽ cĩ khả năng tự lành vết thương sau một thời gian nuơi ở
Hình 20: Cá bị loét màng bụng và gốc vi bụng sau gây nhiễm
Hình 21: Cá bị lĩet màng bụng quanh vết tiêm
4.4. Kết quả thí nghiệm trị bệnh
Theo kết quả phân tích tác nhân gây bệnh từ các mẫu cá bệnh, bệnh thường gặp nhất ở cá Koi là bệnh trụ do vi khuẩn sợi F. columnaris gây ra, bệnh cá thường xảy ra sau khi thay đổi mơi trường nuơi (chuyển cá từ ao/ bè nuơi lên bể), vì vậy việc trị bệnh cá được thực hiện ở 2 giai đoạn đểđánh giá hiệu quả chữa trị.
- giai đoạn sớm: ngay sau khi thay đổi mơi trường nuơi, chưa thấy xuất hiện các biểu hiện bệnh
- giai đoạn bệnh: khi đã thấy xuất hiện dấu hiệu bệnh lý.
Cá sử dụng cho các lơ thí nghiệm trị bệnh được kiểm tra cĩ nhiễm mầm bệnh F. columnaris. Ở giai đoạn sớm, khoảng 20% cá trong lơ bị nhiễm vi khuẩn. Tuy nhiên khi cá cĩ biểu hiện bệnh, 100% cá cĩ sự hiện diện của vi khuẩn này ở cường
độ cao.
4.4.1. Thử nghiệm trị bệnh giai đoạn sớm
* Thí nghiệm 1: Phịng bệnh cá khi chuyển từ ao nuơi lên bể kính.
Cá cĩ trọng lượng 7-10 gram, được tách ra thành 4 lơ thí nghiệm như sau: - Lơ ngâm thuốc tím 1ppm
- Lơ ngâm Oxytetracyclin (OTC) 5 g/100 lít nước - Lơ đối chứng 1 cĩ mật độ 30 con cá /60 lít nước - Lơ đối chứng 2 cĩ mật độ 30 con cá/45 lít nước
Bảng 8: Theo dõi trị bệnh ngay sau khi đưa cá lên bể
Cá chết/ngày theo dõi Lơ thí nghiệm 1 2 3 4 5 6 Tỷ lệ ðối chứng 1 n=30 V=60 lít nước 0 1 5 11 11 11 36,7% ðối chứng 2 n=30 v=45 lít nước 0 2 11 20 20 20 66,7% Ngâm OTC 5g/100L n=30 0 0 0 2 2 2 6,7% Ngâm KMnO4 1ppm n=30 0 1 15 25 25 25 83,3%
Nhận xét: Cá bắt đầu chết sau 2 ngày chuyển về và tăng dần đến ngày thứ 4 ngoại trừ lơ ngâm OTC đến ngày thứ 4 cá mới bắt đầu chết ở tỷ lệ 6,7% (2/30 con). Ở lơ ngâm thuốc tím tỷ lệ chết cao nhất 83,3%. Ở lơ đối chứng 1 và 2 cá bị chết tỷ lệ
cao 36,7% và 66,7% tương ứng, điều này cĩ thể giải thích do lơ 2 mật độ nuơi cao hơn nên nồng độ các chất ơ nhiễm cao hơn, dẫn đến cá chết nhiều hơn. Ở lơ ngâm thuốc tím (KMnO4), tỷ lệ cá chết cao 83,3%, cĩ thể do khi mang cá bị tổn thương, việc sử dụng thuốc tím để chữa trị khơng phải là biện pháp thích hợp.
Từ kết quả thí nghiệm trên cho thấy việc sử dụng kháng sinh OTC trong phịng bệnh do vi khuẩn sợi ở cá tương đối cĩ hiệu quả vì vậy kháng sinh OTC được tiếp tục thử nghiệm với những nồng độđiều trị khác ở thí nghiệm sau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Thí nghiệm 2: Phịng bệnh cá bằng kháng sinh và muối.
Cá cĩ trọng lượng 5-10 gram, được tách ra thành 4 lơ thí nghiệm như sau: - Lơ đối chứng
- Lơ ngâm OTC 5g/100L nước - Lơ ngâm OTC 10g/100L nước - Lơ ngâm NaCl 1,5%