(Theo Liopo G., 2002)
* Chuẩn bị tế bào cá trên tấm nhựa 24 lỗ:
- Các tế bào đã mọc đầy chai nuơi cấy được tách bằng Trypsine. Bổ sung 5 ml L-15, dùng pipette hút lên xuống nhẹ nhàng để tế bào tách ra thành từng tế bào riêng lẻ.
- Bổ sung thêm 20 ml L-15, trộn đều bằng pipette. Hút huyền dịch tế bào vào đĩa nhựa 24 giếng, mỗi giếng 1 ml.
- Ủở 250C trong 24h.
* Phương pháp tách chiết virus từ mơ tế bào bị nhiễm:
- Lấy 1g mẫu mơ, cơ quan nội tạng (lách, não, thận, gan). Mẫu được nghiền kỹ trong cối chày sứ vơ trùng.
- Pha lỗng mẫu bằng L-15 tỷ lệ 1:10 bằng cách bổ sung 9 ml mơi trường. Ly tâm 2000 rpm ở 40C trong 15 phút. Lọc qua màng Millipore 0,45 µm.
- Dịch lọc được giữ lạnh ở 40C trong vịng 3 – 4h và sẵn sàng để gây nhiễm
* Phân lập virus:
- Virus được phân lập trên tấm nhựa 24 giếng đã cĩ sẵn tế bào nuơi cấy sau 24 -48h.
- Hút bỏ mơi trường nuơi cấy cũ trong các giếng. Hút 0,1 ml dịch mẫu đã nghiền ở phần tách chiết virus trên vào mỗi giếng.
- Cho hấp phụ 1h ở 250C.
- Thêm vào 1ml L-15 5% FBS 100 UI/ml cĩ bổ sung kháng sinh Ampicillin vào mỗi giếng, ủở 250C.
- Soi tế bào hàng ngày để kiểm tra CPE, ít nhất trong vịng 14 ngày. - Cấy chuyển mù dịch nuơi cấy kể từ ngày thứ 10 trở đi nếu khơng quan
sát thấy CPE.
Cĩ thể cấy chuyển mù lần thứ 3 nếu khơng quan sát thấy CPE ở lần thứ 2.
Những mẫu quan sát thấy CPE tiếp tục được tăng sinh để thu lượng virus lớn hơn, giữ
ở -800C để cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.3.5.2. Xác định virus bằng kỹ thuật immunoperoxidase (đối với KHV và SVCV) Nguyên tắc:
Tế bào từ những giếng cĩ biểu hiện CPE qua nuơi cấy phân lập trên đĩa 24 giếng được cố định. Kháng thể đơn dịng đặc hiệu của virus được cho vào để kết hợp với virus (kháng thể sơ cấp). Các gắn kết đặc hiệu sẽđược giữ lại sau quá trình rửa. Sau đĩ ủ với cộng hợp peroxidase từ globulin miễn dịch ở dê kháng đặc hiệu với globulin miễn dịch
ở chuột (kháng thể thứ cấp). Phản ứng màu được thể hiện nhờ sự kết hợp giữa men peroxidase với hỗn hợp cơ chất tạo màu AEC/chất nền tạo nên màu đỏ gạch xuất hiện sau vài phút ở những vị trí virus tăng sinh.
Phương pháp:
- Dùng những giếng tế bào cĩ biểu hiện CPE, loại bỏ mơi trường cũ. Cố định tế bào bằng dung dịch aceton vào mỗi giếng
- Ủđĩa ở 40C trong 20 phút
- Úp ngược đĩa để lọai bỏ aceton, rửa bằng dung dịch rửa PBS
- Loại bỏ dung dịch rửa, thêm 200 µl dung dịch kháng thể sơ cấp vào mỗi giếng
- Ủđĩa ở nhiệt độ phịng trong 1 giờ
- Rửa đĩa bằng dung dịch rửa, thêm 200 µl cộng hợp peroxidase, ủ đĩa ở
nhiệt độ phịng trong 1 giờ. - Rửa đĩa giống như bước trên.
- Thêm 500 µl hỗn hợp cơ chất tạo màu gồm AEC+H2O2 - Ủở nhiệt độ phịng trong 30-60 phút, tránh ánh sáng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- ðọc kết quả dưới kính hiển vi soi ngược. Nếu mẫu cĩ chứa virus tương
ứng với kháng thểđặc hiệu đưa vào, lớp tế bào sẽ cĩ màu đỏ gạch.
3.4. Phương pháp thử nghiệm kháng sinh đồ
(Theo Lý Thị Thanh Loan, 2003).
- Huyền phù vi khuẩn cần thử nghiệm kháng sinh đồ vào trong ống nghiệm cĩ chứa nước cất vơ trùng tương ứng với độ đục ống số 3 Mac Flan (9x108CFU/ml), lắc đều.
- Dùng pipette vơ trùng hút 500µL huyền dịch vi khuẩn rồi cẩn thận nhỏ
lên bề mặt đĩa petri cĩ chứa mơi trường MHA.
- Nhẹ nhàng trải huyền dịch vi khuẩn đều khắp bề mặt đĩa thạch bằng que trải thủy tinh.
- ðể đĩa thạch khơ tự nhiên trong khoảng 1 phút rồi đặt các đĩa giấy đã tẩm kháng sinh lên đĩa thạch (tối đa 5 đĩa giấy/đĩa thạch).
- Lật úp đĩa thạch rồi ủ qua đêm ở nhiệt độ thích hợp. - ðo đường kính vịng vơ khuẩn.
3.5. Phương pháp cảm nhiễm ngược vi khuẩn
Tiến hành gây nhiễm vi khuẩn trên cá khoẻ (cá Dĩa khoảng 4-5cm, cá Koi 5-10g) được nuơi thuần trong vịng 10 ngày ở nhiệt độ phịng. Thí nghiệm được chia thành các lơ khác nhau, được nuơi trong bể kính cĩ dung tích 100 lít, sục khí, thay nước hàng ngày. Mỗi lơ được gây nhiễm bằng cách tiêm xoang bụng 0,1ml vi khuẩn với các nồng độ
khác nhau. ðồng thời tiêm lơ đối chứng với 0,1ml nước muối sinh lý.
Theo dõi, ghi chép những biểu hiện của cá sau khi tiêm, mổ khám ghi nhận những bệnh tích bên trong, thu mẫu phân lập lại đối với những con vừa chết hoặc gần chết.
Ki m tra t l nhi m, c ng c m nhi m C m nhi m ng c Xác nh tác nhân gây b nh Quy trình phịng và tr b nh S B TRÍ THÍ NGHI M i u tra tình hình nuơi và d ch b nh ánh giá s b tình hình nuơi và d ch b nh Thu m u cá cĩ bi u hi n b nh nh danh ký sinh trùng Phân l p, nh danh vi khu n Phân l p virus Thu m u n c ki m tra y u t lý hố
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
A. CÁ KOI
4.1. Kết quảđiều tra tình hình nuơi và bệnh
ðiều tra tình hình nuơi và dịch bệnh trên cá Koi ở 15 hộ nuơi (9 hộ nuơi ao và 6 hộ
nuơi bè) cá Koi bao gồm Thành Phố Hồ Chí Minh 6 hộ (các quận 8, 9, 12, Bình Thạnh, Gị Vấp), tỉnh Long An 3 hộ (Bến Lức, Tân An) và tỉnh ðồng Nai 6 hộ (Trị
An, Tân Mai, An Bình).
4.1.1. Tình hình nuơi
ðối tượng nuơi: Cá Koi chủ yếu được nuơi ao hoặc nuơi bè cho đến khi thành cá thương phẩm sẽ được chuyển lên nuơi ở bể ximăng hoặc bể kính. Trong các hộ
nuơi cĩ 10/15 (66,7%) hộ nuơi từ cá bố mẹ, tự sản xuất giống và nuơi lên cá thương phẩm, 2/15 hộ (13,3%) chỉ nuơi cá bố mẹ và 3/15 hộ (20%) chỉ nuơi cá thương phẩm.
Nguồn thức ăn: chủ yếu là trùn chỉ, bo bo đối với cá bột và cá giống, cịn cá bố mẹ
và cá thương phẩm thường sử dụng thức ăn cơng nghiệp và thức ăn tự pha chế
giữa cám với cá tươi.
Kinh nghiệm nuơi: ða số các hộ cĩ kinh nghiệm nuơi cá từ 3-10 năm, cĩ hộ lên
đến 20 năm.
Hình thức nuơi: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Nuơi bè: Mật độ nuơi từ 50-100 con/m2, giống được thả quanh năm khi kết thúc vụ nuơi trước là thả lại ngay, thời gian 1 vụ nuơi thường 4,5 tháng đến 6 tháng. Cá giống thường được xử lý trước khi thả nuơi, một số hĩa chất để xử lý như: muối, iodin, kháng sinh Oxytetracycline tắm trong 1 phút hoặc ngâm Tetracycline trong 1 giờ với liều lượng 1-2 viên/bao. Thức ăn thường dùng là thức
ăn cơng nghiệp như Cargill, và thức ăn tự phối trộn cĩ kết hợp với vitamin.
+ Nuơi ao: Ao nuơi được xử lý trước khi lấy nước trực tiếp từ sơng vào. Trước mỗi vụ nuơi cĩ xử lý ao bằng cách phơi ao 2-3 ngày, bĩn vơi với liều lượng 2,5-3 kg/100 m2, tiếp tục phơi 5-7 ngày rồi lấy nước vào, bĩn phân hữu cơ sau 1 tuần bắt đầu thả cá. Cá nhỏ cho ăn tảo Spirulina hoặc bobo, đối với cá lớn cho ăn thức ăn cơng nghiệp dạng viên. Một số hộ cho ăn thức ăn tự phối trộn cám xay, tấm, bèo. Nước cho ra vào trực tiếp theo thủy triều thường thay khoảng 30% và châm thêm khi hụt nước.
4.1.2. Tình hình bệnh
Tuột nhớt: Cơ thể cá bị mất nhớt, cứng mình, trắng mắt, xảy ra đồng lọat sau vài giờ, cá thường ít hoạt động nên cịn gọi là bệnh ngủ. Bệnh thường xảy ra vào đầu mùa mưa (tháng 4 đến tháng 6), ở mọi lứa tuổi và cỡ cá, gây chết từ rải rác đến hàng loạt nếu khơng xử lý kịp thời. Thường cá nhỏ chết nhiều hơn cá lớn. Tỷ lệ
chết từ 60-70%. Qua khảo sát cho thấy bệnh này xảy ra ở 7/15 hộ khảo sát (46,7%), trong đĩ 4 hộ nuơi ao và 3 hộ nuơi bè. Phịng trị bằng cách ngâm nước muối với nồng độ 3-7‰ trong 12 giờ sau 2-3 ngày hoặc thay 70% nước, bĩn vơi nâng pH thì bớt bệnh.
Lở loét: Thân bị ghẻ trĩc, lở loét, trầy da, đốm đỏ, cá bơi lờđờ, bỏăn. Bệnh xảy ra
ở mọi lứa tuổi với kiểu chết rải rác. Bệnh xảy ra 7/15 hộ nuơi (46,7%), trong đĩ xảy ra ở các hộ nuơi cá trong bè là 4 hộ và 3 hộ ở cá nuơi ao. Nguyên nhân của bệnh theo người nuơi là do mơi trường nước xấu, cá bơi va chạm vào nhau gây tổn thương là cơ hội cho các mầm bệnh phát sinh gây lở loét, nếu gặp trường hợp cá
đang suy yếu thì bệnh sẽ nặng hơn. Dùng formol với nồng độ 5 ml/100 lít nước hết bệnh sau 3 ngày, hoặc tắm muối 1,5 kg/20 lít nước hoặc cho ăn kháng sinh Oxytetracyclin, cĩ thể ngâm Tetracycline trong hồ 1-2 viên/20 lít nước.
Phù mang: mang cĩ mủ, các sợi mang dính lại với nhau, nhiều nhớt, nhạt màu và hoại tử làm cho cá khĩ thở nên dễ xảy ra chết hàng loạt với tỷ lệ 60-70%, bệnh thường xảy ra vào mùa lạnh. Trong các hộ khảo sát cĩ 5/15 hộ (33,3%) cĩ bệnh này, xảy ra ở 3 hộ nuơi bè và 2 hộ nuơi ao. Sử dụng đồng sunfat 2,5 ppm tắm trong hồ, sục khí mạnh bệnh sẽ khỏi sau 24 giờ. Cĩ thể dùng muối để tắm hoặc formol, xanh malachite.
ðốm trắng: Trên da cĩ những đốm trắng. Bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi cá, gây cho cá khĩ chịu nhưng khơng gây chết. Bệnh xảy ra ở 2/15 hộ nuơi (13,3%) trong đĩ 1 hộ nuơi ao và 1 hộ nuơi bè. Các hộ chữa trị bằng cách dùng muối để tắm hoặc formol, hoặc xanh malachite.
ðường ruột: Bụng cá bị chướng to, cá bắt đầu chán ăn rồi bỏăn hồn tồn sau 3-4 ngày bị chết. Thường chết rải rác với tỉ lệ dưới 5%. Bệnh xảy ra ở mọi tuổi và cỡ
cá, gặp ở 1/15 hộ nuơi (chiếm 6,7%). Chữa trị bằng cách cho ăn kháng sinh Vime- ciprocin 500 g/300 kg cá trộn với thức ăn.
Theo người nuơi, những trở ngại lớn trong nghề nuơi cá cảnh hiện nay là nguồn nước và thị trường.
Bảng 1: Các triệu chứng thường gặp ở cá Koi
Triệu chứng Tỷ lệ Tỷ lệ (%) Tuột nhớt 7/15 46,7 Lở loét 7/15 46,7 Phù mang 5/15 33,3 ðốm trắng 2/15 13,3 ðường ruột 1/15 6,7
4.2. Kết quả phân lập tác nhân gây bệnh
Các tế bào EPC và KF-1 được nuơi cấy trong chai 25 cm2, sử dụng mơi trường L- 15, bổ sung 10% FBS và kháng sinh, kháng nấm ở 200C. Tế bào mọc đầy chai sau 1 ngày nuơi cấy đối với tế bào EPC và 2-3 ngày nuơi cấy đối với tế bào KF-1. Các tế bào sau khi mọc đầy chai nuơi cấy được nuơi cấy trong đĩa nhựa 24 giếng
để phân lập virus. Mẫu cá với các dấu hiệu điển hình như ít hoạt động, xuất huyết vây, sưng hậu mơn, mang nhạt, tưa, hoại tử…được sử dụng để phân lập virus. Dịch lọc của các mẫu nội tạng (thận, lách, gan, não) được gây nhiễm vào 2 dịng tế
bào KF-1và EPC và theo dõi tác động bệnh lý tế bào (Cytopathic effect – CPE) hàng ngày.
Trên các mẫu đối chứng: khi cấy chủng SVCV, biểu hiện CPE quan sát được trên tế bào EPC sau 3-5 ngày gây nhiễm. Lớp tế bào bị phân giải, các tế bào teo nhỏ và từ từ bị dung giải hồn tồn sau một thời gian. ðối với chủng KHV, CPE quan sát thấy chậm hơn, sau 8-10 ngày gây nhiễm. Sự xâm nhiễm của KHV tạo ra những lỗ
khơng bào trên tế bào KF-1.
Hình 4: Tế bào EPC lớp đơn Hình 5: Tế bào KF-1 lớp đơn
Hình 6: CPE trên tế bào EPC khi gây nhiễm SVCV: lớp tế bào bị rách, tế bào teo nhỏ
Hình 7: CPE trên tế bào KF-1 khi gây nhiễm KHV: những khơng bào trong tế
bào
Hai chủng SVCV và KHV được gây nhiễm trên tế bào EPC và KF-1 trong đĩa 24 giếng. Quan sát biểu hiện bệnh lý tế bào sau thời gian 1-2 ngày vừa đủ để virus xâm nhiễm vào tế bào. Cốđịnh tế bào bằng aceton.
Hai loại kháng thể đơn dịng đặc hiệu của KHV và SVC (KHV-specific monoclonal antibody và SVC- specific monoclonal antibody). Sau đĩ ủ với cộng hợp peroxidase từ globulin miễn dịch ở dê kháng đặc hiệu với globulin miễn dịch
ở chuột (kháng thể thứ cấp). Phản ứng màu được thể hiện nhờ sự kết hợp giữa men peroxidase với hỗn hợp cơ chất tạo màu AEC/chất nền tạo nên màu đỏ gạch xuất hiện sau vài phút ở những vị trí virus tăng sinh.
Hình 8: Tế bào EPC bình thường khơng bắt màu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 9: Những tế bào EPC nhiễm SVCV bắt màu đỏ gạch
4.2.1.3. Kết quả phân lập SVCV và KHV:
Qua 15 đợt thu mẫu khi cá bị bệnh, với biểu hiện tưa đuơi, vây, loét gốc đuơi, mang hoại tử, xuất huyết các gốc vây và cĩ dịch vàng trong xoang bụng bao gồm 118 mẫu, khơng quan sát thấy CPE do nhiễm SVCV và KHV trên tế bào.
ðối với mẫu cá koi cĩ biểu hiện bình thường được thu ngẫu nhiên theo tỷ lệ trên quần đàn của các trại ở tại các quận, huyện gồm Củ Chi, Hĩc Mơn, quận 12 và Quận 9 tổng cộng 237 mẫu đủ kích cỡ từ cá giống đến cá bố mẹ trong 2 đợt tháng 7 và tháng 12 năm 2007 đều cho kết quả âm tính cả 2 loại virus SVC và virus KHV.
4.2.2. Kết quả phân lập vi khuẩn
Mẫu được thu vào thời điểm cá bệnh. Tất cả các mẫu được thu từ cá bệnh sau khi chuyển lên bể 3-5 ngày. Cá cĩ hiện tượng nằm đáy, bơi lờđờ, thân xuất huyết hoặc khơng, mang hoại tử nặng, các sợi mang cĩ tiết nhiều nhớt và dính lại. Quan sát nội tạng cho thấy thận và lách bình thường, một số trường hợp lách bị sưng. Mẫu kiểm tra vi khuẩn được lấy trực tiếp từ gan, thận và mang.
Flexibacter columaris cĩ hình dạng khác biệt so với các loại vi khuẩn khác: dài, mảnh, khơng roi, chuyển động theo dạng trượt. Theo Sniesco (1981), việc chẩn
đốn vi khuẩn này cĩ thể dựa vào việc quan sát vi khuẩn từ vết phiết tươi mẫu mang hoặc các kỹ thuật nhuộm khác, đồng thời, do F. columnaris khơng mọc trên mơi trường dinh dưỡng thường sử dụng cho nuơi cấy vi khuẩn (thạch máu, BHIA) vì vậy kỹ thuật soi tươi và nhuộm Giemsa được sử dụng để xác định sự hiện diện của vi khuẩn này.
Những trường hợp cá bị bệnh cĩ biểu hiện đặc trưng, vi khuẩn sợi quan sát thấy rất nhiều trên mẫu soi tươi của mang và nhớt, tuy nhiên mật độ vi khuẩn ở dịch nhớt thường thấp hơn mang. Khơng thấy cĩ sự hiện diện của vi khuẩn này trên lách và thận. Vi khuẩn cĩ dạng sợi rất mảnh, kích thước chiều dài 4- 5µm, khơng roi, di động bằng cách trượt.
Bảng 2: Kết quả phân tích vi khuẩn trên cá Koi
Vi khuẩn Số mẫu nhiễm/ tổng số mẫu Tỷ lệ (%) F. columnaris 40/40 100 A. hydrophila 46/52 90 A. caviae 1/52 1,9 A. sobria 1/52 1,9 Aeromonas sp. 5/52 9,6 A. veroni 2/52 3,8 Vibrio cholerae 3/52 5,7
F. columnaris gây bệnh ở bện ngồi, trên mang, vây và da, khơng thấy sự hiện diện của vi khuẩn trên các cơ quan nội tạng (thận. lách).