3. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn
3.5.2. Xác định hoạt độ β-galactosidase với cơ chất ONPG
Các khuẩn lạc đƣợc chuyển sang nuôi lắc trong môi trƣờng DSM có bổ sung chloramphenicol nồng độ 50 µg/ml, tốc độ lắc 150 vòng/phút ở 370C. Tại thời điểm
7
4
2
pBluescript
52
12h chúng tôi thu dịch và xác định hoạt độ của β-galactosidase với cơ chất ONPG. Kết quả chúng tôi thu đƣợc nhƣ sau:
Khuẩn lạc 7 4 2 PY Chất nền
So màu sản phẩm của ONPG bị phân
giải bởi β- galactosidase
Hoạt độ (U/ml) 12,43 11,18 10,73 0,38 0
Hình 3.13. Xác định hoạt độ β-galactosidase trong các chủng 2, 4 và 7 tại thời điểm 12h
Dựa trên hoạt độ β galactosidase của các chủng khuẩn lạc số 2, 4, 7 (khác biệt rõ rệt so với chủng B. subtilis PY79), chúng tôi khẳng định đã biểu hiện thành công gen mã hóa cho β galactosidase trong tế bào sinh dƣỡng của vi khuẩn B. subtilis. Hoạt độ của β-galactosidase của các chủng tại các thời điểm 6h, 12h, 24h, 36h, 48h và 60h đƣợc thể hiện trong hình 3.14.
Hình 3.14. Biểu đồ hoạt độ β-galactosidase của các thể tái tổ hợp tại các thời điểm khác nhau
53
Qua biểu đồ nhận thấy rằng các chủng này có hoạt độ β-galactosidase tăng nhanh và biểu hiện cao nhất ở thời điểm 12h, và bắt đầu giảm mạnh ở các thời điểm sau đó (24h, 36h, 48h và 60h). Hoạt độ của β-galactosidase tỉ lệ thuận với các pha sinh trƣởng của B. subtilis PY79.
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hải Yến chỉ ra rằng hoạt độ của β-galactosidase thu đƣợc từ chủng vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16 tại các thời điểm 12h, 24h, 36h, 48h và 60h có giá trị thấp nhất là 238,98 mU/ml và cao nhất là 393,39 mU/ml [9]. Kết quả xác định hoạt độ của β-galactosidase của chúng tôi thu đƣợc từ một khuẩn lạc tại các thời điểm 12h, 24h, 36h, 48h và 60h tƣơng ứng có giá trị thấp nhất là 1860 mU/ml và cao nhất là 12430 mU/ml. So sánh hoạt độ β- galactosidase của hai kết quả trên có thể kết luận là hoạt độ β-galactosidase thu đƣợc từ khuẩn lạc của chúng tôi cao hơn hẳn so với hoạt độ β-galactosidase sinh ra từ nguồn vi khuẩn trong tự nhiên.
So sánh với những nghiên cứu biểu hiện β-galactosidase trong E. coli BL21 của Onladda J. (2009) khi biểu hiện gen mã hóa cho β-galactosidase trong vector pET21a(+) có sử dụng chất cảm ứng IPTG 1 mM thì hoạt độ β-galactosidase cao nhất là 14000 mU/ml [53]. Hoạt độ β-galactosidase của chúng tôi thu đƣợc khi không sử dụng chất cảm ứng IPTG là thấp hơn không đáng kể. Nhƣ vậy có thể nói chúng tôi đã biểu hiện thành công β-galactosidase trong tế bào sinh dƣỡng của B. subtilis PY79 mà không cần sử dụng chất cảm ứng.
54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Thiết kế thành công vector pUL1 mang đoạn promoter PrrnO và vị trí bám ribosome của gen spoVG biểu hiện trong B. subtilis PY79 dựa trên pET28b
2. Nhân dòng thành công gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase trong vector pUL1
3. Nhân dòng thành công đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364
4. Cài nhập và biểu hiện thành công gen mã hóa cho β-galactosidase trong tế bào sinh dƣỡng của chủng B. subtilis PY79 mà không cần sử dụng chất cảm ứng.
KIẾN NGHỊ
1. Tiến hành tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của β-galactosidase 2. Biểu hiện thêm một số chất có hoạt tính mong muốn trong tế bào sinh dƣỡng của B. subtilis PY79 mà không sử dụng chất cảm ứng.
55
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Ngọc Ân, Nguyễn Thị Thu Trang, Nguyễn Thanh Tố Nhi, Hồ Thị Nguyệt Thu, Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thu Hoa (2009) , “Tác dụng in vitro
kháng virus gây bệnh kháng Gumboro và tả gà của Bacillus subtilis tái tổ hợp biểu hiện interferon anpha của gà”, Tuyển tập Hội nghị CNSH toàn quốc Khu vực phía Nam 2009, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, tr. 376-381.
2. Võ Thị Thƣơng Lan (2006), Một số vấn đề cơ bản của sinh học phân tử, NXB ĐH Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội.
3. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2008), Công nghệ DNA tái tổ hợp, NXB ĐH Quốc Gia TP HCM, TP HCM.
4. Đinh Đoàn Long và Đỗ Lê Thăng (2008), Cở sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB ĐH Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội.
5. Phạm Thị Tuyết Ngân, Vũ Ngọc Út, Trƣơng Quốc Phú và Nguyễn Hữu Hiệp (2011), “Ảnh hƣởng của vi khuẩn hữu ích lên các yếu tố môi trƣờng và tôm sú (Penaeus monodon) nuôi trong bể”, Tạp chí Khoa học ĐH Cần Thơ, 20b, tr. 59-68.
6. Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Trần Văn Giang (2008), “Nhân dòng và phân tích trình tự gene mã hoá β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis G1”, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 908, Hà Nội.
7. Trần Linh Thƣớc, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Thị Minh Phƣợng, Võ Minh Trí (2008), “Cấu trúc chủng Bacillus subtilis biểu hiện mini-proinsulin dạng tiết ra môi trƣờng”, Hội nghị khoa học toàn quốc lần IV: Hóa sinh và sinh học phân tử phục vụ, nông , sinh, y học và công nghiệp thực phẩm, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
56
8. Nguyễn Thị Hồng Vân và Bùi Thị Việt Hà (2011), Di truyền học vi sinh vật nhân sơ và virus, NXB giáo dục Việt Nam, Hà Nội.
9. Nguyễn Thị Hải Yến (2003), Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym -galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16, luận văn thạc sỹ sinh học, ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐHQGHN, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
10. Ashlee M. E., Richard L., Roberto K. (2006), “ Bacillus subtilis Genome Diversity”, Journal of bacteriology, 189(3), pp. 1163–1170.
11. Bacillus Subtilis Expression Vectors Product Information and Instructions,
Bacillus genetic stock center catalog vol.4 (2005), Mobitec Molecular biotechnology, Germany.
12. Baillie L. (2001), “The development of new vaccines against Bacillus anthracis”, J. ApplMicrobiol., 91, pp: 609–613.
13. Bandow J. E., Brötz H., Hecker M. (2002), "Bacillus subtilis Tolerance of Moderate Concentrations of Rifampin Involves the σB - Dependent General and Multiple Stress Response”, Journal of Bacteriology, 184(2), pp: 459 - 467. 14. Bui Thu Thuy, Hoang Van Tong, Phan Huong Trang, Phan Tuan Nghia,
Huynh Anh Hong, Simon Cutting, Nguyen Thi Van Anh (2011), “Cloning and expression of streptavidin on the outer coat of Bacillus subtilis PY79 spores”,
VNU Journal of Science, Natural Science and Technology 27, 2S, pp:285.
15. Burbulys D., Trach K. A., Hoch.J. A. (1991), “Initiation of sporulation in B. subtilis is controlled by a multicomponent phosphorelay”, Cell,64, pp:545-552.
16. Coenen T. M. M., Bertens A. M. C., Hoog S. C. M., Verspeek R. C. M. (2000), “Safety evaluation of a lactase enzyme preparation derived from
57
17. Drabner B., Guzman C.A. (2001), “ Elicitation of predictable immune responses by using live bacterial vectors”, Biomol Eng., 17(3), pp:75-82.
18. Driks. A. (1999), “Bacillus subtilis spore coat”, Microbiology and Molecular Biology Reviews , 1, p:63.
19. Duc L. H., Cutting S.M. (2003), “Bacterial spores as heat stable vaccine vehicles”, Expert Opin Biol Ther , 3, pp: 1263-1270.
20. Duncan C. H., Wilson G. A., Young F. E. (1978), “Mechanism of integrating foreign DNA during transformation of Bacillus subtilis”, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 75, pp:3664-3668.
21. Edberg S. C. (1997), “Bacillus subtilis Final Risk Assessment”,US EPA human health assessment: Bacillus subtilis, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C., USA.
22. Ehrlich S. D. (1977), “ Replication and expression of plasmids from
Staphylococcus aureus in Bacillus subtilis”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74, pp:1680-1682.
23. Ehrlich S. D. (1978), “DNA cloning in Bacillus subtilis”,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75, pp:1433-1436.
24. Errington J. (2003), “Regulation of endospore formation in Bacillus subtilis”, Nature Reviews Microbiology, 1, pp: 117.
25. Glick R. Bernard, Pasternak J. Jack (2003), Molecular Biotechnology: Principle and Application, Washington, ASM Press, USA.
26. Graumann P. (2007), “Bacillus: Cellular and Molecular Biology”,
Caister Academic ISBN 978-1-904455-12-7.
27. Gryczan T. J., Dubnau D. (1978), “Construction and properties of chimeric plasmids in Bacillus subtilis”,Proc. Natl. Acad. Sci., 75, pp:1428-1432.
58
28. Gupta D. K., Vyas M. (1989), “ Efficacy of Bacillus subtilis against mosquito larvae (Anophelis culicfacies)”, Zeitschrift fuer Angewandte Zoologie, 76(1), pp: 85-91. 29. Haldenwang W. G., Banner C. D. B., Ollington J. F., Losick R., Hoch J.
A., O'Connor M. B., Sonenshein A. L. (1980), “Mapping a Cloned Gene Under Sporulation Control by Insertion of a Drug-Resistance Marker into the Bacillus subtilis Chromosome”, J. Bacteriol., 142, pp:90-98.
30. Harwood C. R (1989), Bacillus , page 6-39.
31. Heravi K. M., Marian W., Josef A.(2011), “Regulation of mtl operon promoter of Bacillus subtilis: Requirements of its use in expression vectors”,
Microbial Cell Factories, 10 (1), pp: 10- 83.
32. Horwitz J. (1964), “Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-b-D-glycopyranosides”, J.Med. Chem., 7, pp:574-575.
33. Iber D., Clarkson J., Yudkin M. D., Campbell I. D. (2006), “The mechanism of cell differentiation in Bacillus subtilis”, Nature, 441(7091), pp: 371-374.
34. Isticato R., Cangiano G., Tran H. T., Ciabattini A., Medaglini D., Oggioni M. R., De Felice M., Pozzi G., Ricca E. (2001), “Surface display of recombinant proteins on
Bacillus subtilis spores”, J. Bacteriol., 183(21), pp: 6294-301.
35. Kees J. L., Kok J., Gerard V. (1989), “Campbell-Like Integration of Heterologous Plasmid DNA into the Chromosome of Lactococcus lactis subsp.
lactis”, Applied and environmental Microbiology, 55, pp: 394-400.
36. Keggins K. M., Lovett P. S., Duvall.E. J. (1978), “Molecular cloning of genetically active fragments of Bacillus DNA in Bacillus subtilis and properties of the vector plasmid pUB110”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, pp:1423-1427. 37. Kobayashi K., et al. (2003) "Essential Bacillus subtilis genes". Proc.
59
38. Krásný L. and Gourse L. Richard. (2004), “An alternative strategy for bacteria ribosome synthesis: B rRNA transcription regulation”, BMBO Journal,
23, pp: 4473-4483.
39. Kunst F., et al. (1997), "The complete genome sequence of the Gram- positive bacterium Bacillus subtilis". Nature., 390, pp: 249-256.
40. Lee S., Belitsky B. R., Brinker J. P., Kerstein K. O., Brown D.W., Clements J.D., Keusch G. T., Tzipori S., Sonenshein A. L., Herrmann J. E. (2010), “Development of a Bacillus subtilis-based rotavirus vaccine”, Clinical and Vaccine Immunology, 17 (11), pp: 1647-1655.
41. Lepesant-Kejzlaro J., Lepesant J.-A., Walle J., BillaultA. (1975), “ Revision of the linkage map of Bacillus subtilis 168: Indications for circularity of the chromosome”, J. Bacteriol., 121, pp: 823-834.
42. Losick R., and Pero J. (1981), “Cascades of sigma factors”, Cell,25, pp:582-584. 43. Mahler I., Halvorson H. O. (1977), “Transformation of Escherichia coli and
Bacillus subtilis with a hybrid plasmid molecule”, J. Bacteriol.,131, pp:374-377.
44. Marino M., et al.(2001), "Modulation of Anaerobic Energy Metabolism of Bacillus subtilis by arfM (ywiD)". J Bacteriol. 183(23), pp: 6815 - 6821. 45. Mauriello Emilia M. F., Duc Le. H., Isticato R., Cangiano G., Hong
Huynh A., De Felice M., Ricca Ezio, Cutting Simon M. (2004), “Display of heterologous antigens on the Bacillus subtilis spore coat using CotC as a fusion partner”, Vaccine, 22(9-10), pp: 1177-1187.
46. Morikawa M. (2006), "Beneficial Biofilm Formation by Industrial Bacteria Bacillus subtilis and Related Species", Journal of Bioscience and Bioengineering, 10(1), pp: 1-8.
47. Nagy Z., Kiss T., Szentirmai A., Bio S. (2001), “β-Galactosidase of
Penicillium chrysogenum: Production, puification and characterization of the enzyme”, Protein expression and purification, 21(1), pp: 24-29.
60
48. Nakayama T., Amachi T. (1999), “Encyclopedia of bioprocess technology: biocatalysis and bioseparation”, Enzymology , 3, pp:1291-1305. 49. Nguyen H. D., Nguyen, Q. A., Ferreira, R.C., Ferreira, L.C., Tran, L.T. and
Schumann, W. (2005), “Construction of plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis exhibiting full structural stability”, Plasmid, 54, pp: 241-248.
50. Nguyen T. H., Splechtna B., Steinbock M., Kneifel W., Lettner P. H., Kulbe K. D., Haltrich D. (2006), “ Puification and characterization of two novel β-galactosidases from
Lactobacillus reuteri”, Agricultural and Food chemistry, 54, pp: 4989-4998.
51. Nicholson W. & Setlow P. (1990), Molecular Biological Methods for Bacillus, Harwood C. & S. Cutting, New York: John Wiley, pp.391-450, USA. 52. Ogasawara, N., Y. Fujita, Y. Kobayashi, and Sadaie.Y. 1995,
“Systematic sequencing of the Bacillus subtilis genome: progress report of the Japanese group”, Microbiology, 141, pp:257-259.
53. Onladda Juajun (2009), Characterization, cloning, expression and application of bacterial beta-galactosidase, thesis of Suranaree University of Technology, page: 70, Thailand.
54. Perez A.R., Abanes-De Mello A., Pogliano K. (2000), "SpoIIB Localizes to Active Sites of Septal Biogenesis and Spatially Regulates Septal Thinning during Engulfment in Bacillus subtilis", Journal of Bacteriology, 182(4), pp: 1096-1108.
55. Phan T. T. P., Nguyen H. D., Schumann W. (2005), “Novel plasmid- based expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis”, Protein Expr. Purif., 46(2), pp: 189-95
56. Rooney A. P., Neil P. J. P., Ehrhardt C., James L. S., Jason D. B. (2009), “Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species complex and description of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum subsp. nov.”, Appl. Environ. Microbiol, 59(10), pp: 2429-2436.
61
57. Samarrai.W., David X. L., Ann-Marie W., Barbara S., Jacob E., Anita S., Russell L. W., Rivka R. (2010), “Differential Responses of Bacillus subtilis rRNA Promoters to Nutritional Stress”,Journal of Bacteriology, 193(3), pp: 723-733.
58. Sambrook J., Fritsch E.F. and T. Maniatis (1989), “Molecular Cloning A Laboratory Manual”. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press pp:1-74.
59. Sangun L., Boris R. B., James P. B., Kathryn O. K., David W. B., John D. C. , Gerald T. K., Saul T., Abraham L. S., John E. H. (2010), “Development of a Bacillus subtilis-Based Rotavirus Vaccine”, Clin. Vaccine Immunol.,17 ( 11), pp: 1647-1655.
60. Schaechter M., Ingraham J. L., Neidhardt F. C. (2006). Microbe., American Society for Microbiology, Washington, D.C, U.S.A.
61. Schlessinger D. (1976), Microbiology, American Society for Microbiology, Washington, D.C, USA.
62. Spizizen J. (1958), “ Transformation of biochemically deficient strains of Bacillus subtilis by deoxyribonucleate”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,44, pp:1072-1078.
63. Stanghellini M. E., Rasmussen S.L. (1989), “Two new diseases of Salicornia sp. caused by Bacillus subtilis and Macrophomina phaseolina”, Annual Meeting of the American Phytopathological Society, Pacific Division, 79(8), p: 912.
64. Weber, M.H.W., Marahiel, M.A. (1979), “Bacterial cold shock responses”, Science Progress, 86 (2003), pp:9–75. Bacillus subtilis Marburg, Mol. Gen. Genet., 170, pp:117–122.
65. Yang M. M., Zhang W. W., Chen Y. L. và Gong Y. S. (2010) “Development of a Bacillus subtilis expression system using the improved Pglv
promoter”, Microbial Cell Factories, 9:55 doi:10.1186/1475-2859-9-55.
Các trang web 66. http://ars.sciencedirect.com/content/image/1-s2.0-S163106910500065X-gr002.gif 67. http://course1.winona.edu/sberg/308s10/Lec-note/Regulation.htm 68. http://en.citizendium.org/wiki/Bacillus_subtilis 69. http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis 70. http://en.wikipedia.org/wiki/Beta-galactosidase
62 71. http://en.wikipedia.org/wiki/X-gal 72. http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_subtilis 73. http://sporegen.com/contact.html 74. http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Subtilisin 75. http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/cloning/choice_vector/ecoli/vectorfeatures/ 76. http://www.hcmuaf.edu.vn/contents.php?ids=3963&ur=nhtri 77. http://www.museion.ku.dk/2007/06/morbid-anatomy-for-connoisseurs/ 78. http://www.sciencefoto.de/detail.php?id=215017&rubrik=Bio&lang=en&q=&qrubrik 79. http://www.google.com.vn/imgres?q=mechanism+operon+lac 80. http://www.Wikipedia.Plasmid
63
Phụ lục 1: Kết quả giải trình tự PrrnO-RBS (spoVG)-đoạn đầu của lacZ và trình tự đoạn cuối lacZ
64
65