Nguyên tắc: Vô cơ hoá khô là kỹ thuật nung để xử lý mẫu trong lò nung ở một nhiệt độ thích hợp, song thực chất đây chỉ là bước đầu tiên của quá trình xử lý mẫu vì sau khi nung tro mẫu phải được hòa tan (xử lý tiếp) bằng dung dịch muối hay axit phù hợp để chuyển các chất phân tích vào dạng dung dịch. Việc tro hoá thường được bổ sung thêm chất phụ gia bảo vệ hay chất chảy để làm giảm nhiệt độ nóng chảy của mẫu và bảo vệ các nguyên tố phân tích không bị mất trong quá trình xử lý mẫu [1,4].
Trong quá trình nung xử lý mẫu có thể có các quá trình vật lý và hoá học sau đây xảy ra:
- Sự bay hơi làm mất nước hấp thụ và nước kết dính trong chất mẫu - Tro hoá, đốt cháy các chất hữu cơ của mẫu
- Phá vỡ cấu trúc ban đầu của mẫu
- Chuyển dạng các hợp chất phức tạp của mẫu về dạng đơn giản (từ dạng hữu cơ sang vô cơ)
- Quá trình ôxy hoá khử thay đổi hoá trị của nguyên tố trong mẫu - Giải phóng ra một số khí như CO, CO2, SO2, ....
- Có một số tương tác hoá học của các chất với nhau, tương tác với chất phụ gia thêm vào, ... tạo thành các chất lúc đầu không có.
Đối với phân tích hàm lượng các kim loại không bay hơi trong các mẫu có hàm lượng hữu cơ cao, tro hoá khô là một phương pháp tương đối đơn giản để phá vỡ các chất hữu cơ và không tốn nhiều thời gian. Nhược điểm chính của kỹ thuật này là khả năng mất một số nguyên tố phân tích do sự bay hơi hay nhiễm bẩn mẫu bởi bụi trong không khí và sự hấp phụ chất lên chén đựng mẫu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
19
[3]. Nhiều tác giả đã sử dụng kỹ thuật tro hoá khô để xử lý mẫu sinh học nhằm xác định hàm lượng đồng, kẽm, sắt trong mẫu tóc và máu người. Mẫu được cho vào chén thạch anh và đun nhẹ ở nhiệt độ thấp. Sau đó đặt vào lò nung ở 500oC trong 3 giờ. Tro nung được làm ẩm với 0,5 ml nước, sau đó thêm lần lượt 0,5 ml HNO3 và 0,5 ml HClO4 đặc, tiếp tục đun ở 200oC. Tro ẩm được xử lý tiếp với 0,5 ml HNO3 đặc và nước sau đó đun nhẹ cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt. Độ thu hồi khi phân tích các nguyên tố trong mẫu tóc nằm trong khoảng 94 – 108%.
1.5.2. Kỹ thuật vô cơ hoá ƣớt ở áp suất khí quyển
Nguyên tắc: Dùng axit mạnh (ví dụ HCl, H2SO4), hay axit mạnh và có tính ôxy hoá (HNO3, HClO4) hoặc hỗn hợp 2 axit (HNO3 + H2SO4), 3 axit (HNO3 + H2SO4 + HClO4) để phân huỷ mẫu trong điều kiện đun nóng trong bình Kendan, trong cốc thuỷ tinh(hệ hở). Lượng axit thường gấp 10-15 lần lượng mẫu. Thời gian xử lý mẫu thường từ vài giờ đến vài chục giờ [3]. Axit nitric thường được sử dụng nhiều nhất vì nó không tạo thành các muối không tan trong quá trình vô cơ hoá mẫu như HCl và H2SO4. Hydro peroxit H2O2 cũng có thể được thêm vào để tăng khả năng ôxy hoá [1,4]. Các tác nhân phân huỷ mẫu trong quá trình này gồm: tác dụng phá huỷ các hạt mẫu của axit đặc và tác nhân phá huỷ mẫu của năng lượng nhiệt khi đun sôi mẫu. Các tác nhân này bào mòn dần các hạt mẫu từ ngoài vào, làm cho các hạt mẫu bị mòn dần rồi tan hết.
Tuy tương đối đơn giản và không đắt tiền, xử lý mẫu trong cốc hở hay bình Ken dan được sử dụng nhiều trong việc xử lý các mẫu sinh học, mặc dù thời gian phân hủy mẫu bị kéo dài.
1.5.3. Vô cơ hoá mẫu trong lò vi sóng áp suất cao
Phân huỷ mẫu trong hệ kín lò vi sóng có nhiều ưu điểm hơn hệ hở. Các ống đựng mẫu được làm bằng vật liệu polyme chịu áp suất cao, bền với các tác động hoá học, ít chứa các kim loại gây nhiễm bẩn hơn các cốc thuỷ tinh hay
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
20
chén sứ. Vì các ống đựng mẫu được đậy kín nên loại trừ được sự nhiễm bẩn từ không khí, giảm sự bay hơi nên tốn ít axit. Các ống kín cũng loại trừ được sự mất các kim loại dễ bay hơi có thể xảy ra đối với các hệ hở, đặc biệt trong tro hoá khô. Bộ phận điều khiển điện tử ở các lò vi sóng hiện đại giúp việc xử lý mẫu có độ lặp lại cao. Hơn nữa áp suất cao cho phép phân huỷ
hoàn toàn mẫu tóc một cách nhanh chóng [3,22,26].
Trong lò vi sóng, ngoài hai tác nhân phân huỷ mẫu là tác dụng phá huỷ các hạt mẫu của axít đặc và của năng lượng nhiệt, còn có sự phá vỡ từ trong lòng hạt mẫu ra ngoài do các phân tử nước hấp thụ (>90%) năng lượng vi sóng, chúng có chuyển động nhiệt rất lớn làm căng và xé các hạt mẫu từ trong ra. Hơn nữa, việc vô cơ hoá được thực hiện trong hệ kín, áp suất cao nên nhiệt độ sôi cao hơn thúc đẩy quá trình phá huỷ mẫu rất nhanh và đây là tác nhân phá huỷ mạnh nhất. Vì thế việc xử lý mẫu trong lò vi sóng chỉ cần thời gian ngắn (50 – 70 phút) mà rất triệt để [26 ]. Tuy nhiên rất ít công trình sử dụng kỹ thuật này để phân tích đồng trong huyết thanh và nước tiểu.
1.5.4. Kỹ thuật pha loãng và thay đổi thành phần nền
Để phân tích hàm lượng đồng trong huyết thanh và nước tiểu, nhóm tác giả Felix WS [14] đã sử dụng kỹ thuật pha loãng mẫu và chuẩn bị thành phần nền của dung dịch chuẩn giống như thành phần nền của mẫu và xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian thực hiện nhanh, có thể thực hiện phân tích mẫu hàng loạt. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng cho đối tượng là mẫu huyết thanh và nước tiểu, đối với mẫu máu tổng số và các loại dịch sinh học khác không thể áp dụng đựơc. Mặt khác khi sử dụng các phương pháp phân tích khác như đo quang, điện hóa.. thì mẫu cần thiết phải vô cơ hóa theo các kỹ thuật vô cơ hóa khô hoặc vô cơ hóa ướt được đề cập ở các mục trên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
21
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu chúng tôi lựa chọn đó là mẫu sinh học mà cụ thể là huyết thanh, nước tiểu và sinh thiết gan của người bao gồm hai nhóm đối chứng (người bình thường) và nhóm và các bệnh nhân mắc bệnh Wilson.
2.1.1. Mẫu máu
Máu là một tổ chức liên kết đặc biệt gồm hai phần, huyết thanh và các thành phần hữu hình. Huyết thanh gồm nước và các chất hòa tan, trong đó chủ yếu là các loại protein, ngoài ra còn các chất điện giải, chất dinh dưỡng, enzim, hormone, khí và các chất thải. Huyết thanh chiếm 55% - 57% tổng số máu. Huyết thanh bị lấy mất fibrinogen thì được gọi là huyết tương. Thành phần hữu hình là các tế bào, bao gồm tế bào hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu. Khối lượng máu trong cơ thể chiếm 7% - 9% khối lượng cơ thể( khoảng 1/13 thể trọng).Trung bình người trưởng thành cứ 1kg trọng lượng có khoảng 75ml đến 80ml máu, tức là có khoảng 4 đến 5 lít máu. Trẻ sơ sinh có 100ml máu/kg cân nặng, sau đó khối lượng máu giảm dần. Từ 2 -3 tuổi trở đi khối lượng máu lại tăng dần lên, rồi giảm dần cho đến tuổi trưởng thành thì hằng định. Ở nam giới máu nhiều hơn ở nữ giới. Ở động vật, khối lượng máu thay đổi theo loài. Tỷ lệ phần trăm máu so với khối lượng cơ thể ở cá là 3; ếch là 5,7; mèo là 6,6; thỏ là 5,5; chim bồ câu là 9,2; ngựa là 9,8; lợn là 4,6; bò là 8,0 và gà là 8,5...[1,2,18].
Lượng máu thay đổi theo trạng thái sinh lý của cơ thể, lượng máu tăng lên sau khi ăn, uống, khi mang thai, lượng máu giảm khi đói và khi cơ thể mất nước. Trạng thái sinh lý bệnh thường có khoảng ½ lượng máu lưu thông trong mạch, còn ½ dự trữ trong các kho chứa(trong lách 16%, trong gan 20% và dưới da 10%). Khối lượng máu bị giảm đột ngột sẽ gây nguy hiểm đến tính mạng vì làm cho huyết áp giảm nhanh[18].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
22
Việc phân tích hàm lượng đồng trong máu có vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán lâm sàng nhiều bệnh như bệnh Gan, bệnh u sơ tuyến tiền liệt, nhồi máu cơ tim…, đặc biệt là bệnh Wilson. Hàm lượng đồng trong máu phản ánh một cách trực tiếp lượng đồng đưa vào cơ thể.
2.1.2. Mẫu nƣớc tiểu
Nước tiểu là một thành phần được tạo ra bởi quá trình bài tiết với mục đích đào thải các chất cặn bã, các chất thừa… ra khỏi cơ thể, giúp cho cơ thể không bị nhiễm độc và cân bằng nội môi. Nước tiểu được tạo thành từ Nephron – đơn vị chức năng của thận bao gồm quá trình lọc máu ở cầu thận (nang Bowman) tạo thành nước tiểu đầu, quá trình hấp thụ lại các chất cần thiết, quá trình bài tiết tiếp các chất không cần thiết, tạo thành nước tiểu chính thức. Nước tiểu chính thức đổ vào bể thận, theo ống dẫn nước tiểu tích lũy ở bàng quang. Khi đủ một lượng nhất định sẽ được thải ra ngoài, mỗi ngày cơ thể loại ra ngoài khoảng 1 đến 2 lít nước tiểu[1,12]. Hàm lượng đồng trong nước tiểu phản ánh khả năng tự đào thải đồng của cơ thể và là chỉ số phân tích cận lâm sàng rất quan trọng trong quá trình điều trị các bệnh có liên quan đến hàm lượng đồng.
2.1.3. Mẫu sinh thiết gan
Sinh thiết gan là một thủ thuật y khoa, trong đó bác sĩ dùng một mũi kim đặc biệt để lấy ra một mẫu mô nhỏ từ gan để kiểm tra các triệu chứng tổn thương gan. Sinh thiết gan sẽ giúp chúng ta biết rõ hơn về tình trạng sức khỏe của lá gan. Thủ thuật này là rất quan trọng cho người mắc bệnh viêm gan C hoặc bệnh gan khác và chúng ta đang cố gắng quyết định lựa chọn biện pháp điều trị thích hợp. Sinh thiết gan cũng có thể hữu ích nếu bác sĩ không biết chắc chắn nguyên nhân gây bệnh gan của bệnh nhân.
Khi làm sinh thiết gan người bệnh cần phải nằm ngửa trong thời gian làm thủ thuật. Trước hết, bác sĩ phải tìm một nơi giữa xương sườn bên phải,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
23
nơi có thể làm sinh thiết gan an toàn hơn. Sau đó, lau sạch vùng da trên nơi này và chích thuốc gây tê cục bộ để làm tê vùng đó, khi vùng đó đã được làm tê, một mũi kim sinh thiết được đưa vào để lấy ra một mẫu gan nhỏ. Phần thủ thuật này được thực hiện nhanh chóng, sau khi làm sinh thiết người bệnh phải nằm nghiêng và giữ nguyên tư thế đó trong 1 hoặc 2 giờ đồng hồ. Làm như vậy sẽ tạo sức ép lên vùng đã làm sinh thiết gan để không bị chảy máu khi gặp các vấn đề khác do ngồi dậy quá sớm[19,20,22].
2.2 Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện mục tiêu của đề tài, nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm những vấn đề sau:
- Nghiên cứu các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng.
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng. - Nghiên cứu và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp để định lượng đồng trong máu và nước tiểu và sinh thiết gan.
- Xây dựng quy trình phân tích chính xác hàm lượng đồng trong máu và nước tiểu và sinh thiết gan bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử.
- Phân tích, đánh giá hàm lượng đồng trong máu, nước tiểu và sinh thiết gan của người bình thường và bệnh nhân mắc bệnh Wilson.
2.3. Lấy mẫu và bảo quản mẫu 2.3.1. Mẫu máu 2.3.1. Mẫu máu
Mẫu máu được lấy qua tĩnh mạch vào buổi sáng, lấy khoảng 2ml mẫu máu cho vào ống nghiệm, ly tâm để tách huyết thanh, cho vào các ống bằng polypropylen có đậy nắp kín. Bảo quản lạnh ở -200C đến khi sử dụng, mẫu bảo quản ở điều kiện này có thể đảm bảo ổn định trong vòng một tháng.
Các mẫu huyết thanh lấy từ tủ lạnh và để chảy đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, sau đó lắc đều.
Lấy 0,5ml huyết thanh đã để rã đông, thêm 0,5ml nước cất, lắc đều sau đó tiến hành xác định hàm lượng đồng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
24
2.3.2. Mẫu nƣớc tiểu
Nước tiểu được lấy trong 24 giờ, trộn đều ghi lại thể tích mẫu tổng số. Lấy khoảng 50ml mẫu cho vào bình teflon và bảo quản lạnh[2,13,14].
2.3.3. Mẫu sinh thiết gan
Mẫu sinh thiết gan được lấy bằng kim sinh thiết sau đó bảo quản lạnh ở nhiệt độ -20oC, trước khi phân tích mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi. Quy trình xử lý mẫu sinh thiết gan được tiến hành như sau:
Cân chính xác 0,1 gam mẫu cho vào bình vô cơ hóa, thêm 8ml hỗn hợp axit HNO3 – HClO4(tỷ lệ 1:1) đun ở 1500
C trong vòng 30 phút, sau đó định mức đến 25ml bằng nước cất. Hàm lượng đồng trong mẫu được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật ngọn lửa.
2.4. Trang thiết bị và hoá chất phục vụ nghiên cứu 2.4.1. Trang thiết bị 2.4.1. Trang thiết bị
- Hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS-3300 của hãng Perkin-Elmer. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Hệ thống nguyên tử hoá bằng ngọn lửa của hãng Perkin-Elmer. - Cân phân tích chính xác đến 0.01mg.
- Máy ly tâm tốc độ tối đa 12.000 vòng/phút. - Tủ lạnh để bảo quản mẫu.
2.4.2. Hoá chất và dụng cụ
Do yêu cầu nghiêm ngặt của phép đo AAS nên nước cất, hoá chất phải có độ tinh khiết cao, được kiểm tra nồng độ nguyên tố bằng phép đo AAS trước khi dùng. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng các loại hóa chất và dụng cụ sau:
2.4.2.1. Hóa chất
- Dung dịch chuẩn đồng 1000 ppm. - Glyxerin.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
25 - NaCl, MgCl2, KCl, CaCl2 tinh khiết. - HCl 12M. HNO3, HClO4.
- Etanol 98%. - Nước cất.
2.4.2.2. Dụng cụ
Ống nghiệm, pipet, bình định mức 50ml, 100ml, giá đựng ống nghiệm, đũa thủy tinh, ống đong…
2.4.3. Chuẩn bị hóa chất và dung dịch chuẩn
1)Dung dịch Na 10g/l: Cân chính xác 2,543gam NaCl pha trong 100ml nước cất.
2) Dung dịch K 10g/l: Cân chính xác 1,9102 gam KCl pha trong 100ml nước cất.
3) Dung dịch Ca 10g/l: Cân chính xác 2,775gam CaCl2 pha trong 100ml nước cất.
4) Dung dich chuẩn Mg 1000mg/l.
5) Dung dịch glyxerin 50%: lấy 50ml glyxerin 100% pha với 50ml nước cất. 6) Dung dịch HCl 6M: lấy 50ml HCl 36,5%(6M) pha với 50ml nước cất. 7) Dung dịch chuẩn đồng nồng độ 10ppm: lấy 1ml Cu 1000ppm cho vào bình định mức 100ml, sau đó định mức với nước cất để được 100 ml dung dịch chuẩn Cu nồng độ 10ppm.
2.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Kết quả thực nghiệm thu được trong quá trình nghiên cứu được xử lý theo các quy luật thống kê để đánh giá sai số, độ lặp lại, độ thu hồi, giới hạn phát hiện…
Phân tích phương sai một yếu tố
Phân tích phương sai là phân tích tác động của các yếu tố qua tham số phương sai; nó được dùng nhiều trong các trắc nghiệm để đánh giá những
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
26
nguồn sai số khác nhau liên quan đến dãy kết quả thí nghiệm. Mục đích của sự