Để phân tích hàm lượng đồng trong huyết thanh và nước tiểu, nhóm tác giả Felix WS [14] đã sử dụng kỹ thuật pha loãng mẫu và chuẩn bị thành phần nền của dung dịch chuẩn giống như thành phần nền của mẫu và xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian thực hiện nhanh, có thể thực hiện phân tích mẫu hàng loạt. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng cho đối tượng là mẫu huyết thanh và nước tiểu, đối với mẫu máu tổng số và các loại dịch sinh học khác không thể áp dụng đựơc. Mặt khác khi sử dụng các phương pháp phân tích khác như đo quang, điện hóa.. thì mẫu cần thiết phải vô cơ hóa theo các kỹ thuật vô cơ hóa khô hoặc vô cơ hóa ướt được đề cập ở các mục trên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
21
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu chúng tôi lựa chọn đó là mẫu sinh học mà cụ thể là huyết thanh, nước tiểu và sinh thiết gan của người bao gồm hai nhóm đối chứng (người bình thường) và nhóm và các bệnh nhân mắc bệnh Wilson.
2.1.1. Mẫu máu
Máu là một tổ chức liên kết đặc biệt gồm hai phần, huyết thanh và các thành phần hữu hình. Huyết thanh gồm nước và các chất hòa tan, trong đó chủ yếu là các loại protein, ngoài ra còn các chất điện giải, chất dinh dưỡng, enzim, hormone, khí và các chất thải. Huyết thanh chiếm 55% - 57% tổng số máu. Huyết thanh bị lấy mất fibrinogen thì được gọi là huyết tương. Thành phần hữu hình là các tế bào, bao gồm tế bào hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu. Khối lượng máu trong cơ thể chiếm 7% - 9% khối lượng cơ thể( khoảng 1/13 thể trọng).Trung bình người trưởng thành cứ 1kg trọng lượng có khoảng 75ml đến 80ml máu, tức là có khoảng 4 đến 5 lít máu. Trẻ sơ sinh có 100ml máu/kg cân nặng, sau đó khối lượng máu giảm dần. Từ 2 -3 tuổi trở đi khối lượng máu lại tăng dần lên, rồi giảm dần cho đến tuổi trưởng thành thì hằng định. Ở nam giới máu nhiều hơn ở nữ giới. Ở động vật, khối lượng máu thay đổi theo loài. Tỷ lệ phần trăm máu so với khối lượng cơ thể ở cá là 3; ếch là 5,7; mèo là 6,6; thỏ là 5,5; chim bồ câu là 9,2; ngựa là 9,8; lợn là 4,6; bò là 8,0 và gà là 8,5...[1,2,18].
Lượng máu thay đổi theo trạng thái sinh lý của cơ thể, lượng máu tăng lên sau khi ăn, uống, khi mang thai, lượng máu giảm khi đói và khi cơ thể mất nước. Trạng thái sinh lý bệnh thường có khoảng ½ lượng máu lưu thông trong mạch, còn ½ dự trữ trong các kho chứa(trong lách 16%, trong gan 20% và dưới da 10%). Khối lượng máu bị giảm đột ngột sẽ gây nguy hiểm đến tính mạng vì làm cho huyết áp giảm nhanh[18].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
22
Việc phân tích hàm lượng đồng trong máu có vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán lâm sàng nhiều bệnh như bệnh Gan, bệnh u sơ tuyến tiền liệt, nhồi máu cơ tim…, đặc biệt là bệnh Wilson. Hàm lượng đồng trong máu phản ánh một cách trực tiếp lượng đồng đưa vào cơ thể.
2.1.2. Mẫu nƣớc tiểu
Nước tiểu là một thành phần được tạo ra bởi quá trình bài tiết với mục đích đào thải các chất cặn bã, các chất thừa… ra khỏi cơ thể, giúp cho cơ thể không bị nhiễm độc và cân bằng nội môi. Nước tiểu được tạo thành từ Nephron – đơn vị chức năng của thận bao gồm quá trình lọc máu ở cầu thận (nang Bowman) tạo thành nước tiểu đầu, quá trình hấp thụ lại các chất cần thiết, quá trình bài tiết tiếp các chất không cần thiết, tạo thành nước tiểu chính thức. Nước tiểu chính thức đổ vào bể thận, theo ống dẫn nước tiểu tích lũy ở bàng quang. Khi đủ một lượng nhất định sẽ được thải ra ngoài, mỗi ngày cơ thể loại ra ngoài khoảng 1 đến 2 lít nước tiểu[1,12]. Hàm lượng đồng trong nước tiểu phản ánh khả năng tự đào thải đồng của cơ thể và là chỉ số phân tích cận lâm sàng rất quan trọng trong quá trình điều trị các bệnh có liên quan đến hàm lượng đồng.
2.1.3. Mẫu sinh thiết gan
Sinh thiết gan là một thủ thuật y khoa, trong đó bác sĩ dùng một mũi kim đặc biệt để lấy ra một mẫu mô nhỏ từ gan để kiểm tra các triệu chứng tổn thương gan. Sinh thiết gan sẽ giúp chúng ta biết rõ hơn về tình trạng sức khỏe của lá gan. Thủ thuật này là rất quan trọng cho người mắc bệnh viêm gan C hoặc bệnh gan khác và chúng ta đang cố gắng quyết định lựa chọn biện pháp điều trị thích hợp. Sinh thiết gan cũng có thể hữu ích nếu bác sĩ không biết chắc chắn nguyên nhân gây bệnh gan của bệnh nhân.
Khi làm sinh thiết gan người bệnh cần phải nằm ngửa trong thời gian làm thủ thuật. Trước hết, bác sĩ phải tìm một nơi giữa xương sườn bên phải,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
23
nơi có thể làm sinh thiết gan an toàn hơn. Sau đó, lau sạch vùng da trên nơi này và chích thuốc gây tê cục bộ để làm tê vùng đó, khi vùng đó đã được làm tê, một mũi kim sinh thiết được đưa vào để lấy ra một mẫu gan nhỏ. Phần thủ thuật này được thực hiện nhanh chóng, sau khi làm sinh thiết người bệnh phải nằm nghiêng và giữ nguyên tư thế đó trong 1 hoặc 2 giờ đồng hồ. Làm như vậy sẽ tạo sức ép lên vùng đã làm sinh thiết gan để không bị chảy máu khi gặp các vấn đề khác do ngồi dậy quá sớm[19,20,22].
2.2 Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện mục tiêu của đề tài, nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm những vấn đề sau:
- Nghiên cứu các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng.
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng. - Nghiên cứu và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp để định lượng đồng trong máu và nước tiểu và sinh thiết gan.
- Xây dựng quy trình phân tích chính xác hàm lượng đồng trong máu và nước tiểu và sinh thiết gan bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử.
- Phân tích, đánh giá hàm lượng đồng trong máu, nước tiểu và sinh thiết gan của người bình thường và bệnh nhân mắc bệnh Wilson.
2.3. Lấy mẫu và bảo quản mẫu 2.3.1. Mẫu máu 2.3.1. Mẫu máu
Mẫu máu được lấy qua tĩnh mạch vào buổi sáng, lấy khoảng 2ml mẫu máu cho vào ống nghiệm, ly tâm để tách huyết thanh, cho vào các ống bằng polypropylen có đậy nắp kín. Bảo quản lạnh ở -200C đến khi sử dụng, mẫu bảo quản ở điều kiện này có thể đảm bảo ổn định trong vòng một tháng.
Các mẫu huyết thanh lấy từ tủ lạnh và để chảy đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, sau đó lắc đều.
Lấy 0,5ml huyết thanh đã để rã đông, thêm 0,5ml nước cất, lắc đều sau đó tiến hành xác định hàm lượng đồng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
24
2.3.2. Mẫu nƣớc tiểu
Nước tiểu được lấy trong 24 giờ, trộn đều ghi lại thể tích mẫu tổng số. Lấy khoảng 50ml mẫu cho vào bình teflon và bảo quản lạnh[2,13,14].
2.3.3. Mẫu sinh thiết gan
Mẫu sinh thiết gan được lấy bằng kim sinh thiết sau đó bảo quản lạnh ở nhiệt độ -20oC, trước khi phân tích mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi. Quy trình xử lý mẫu sinh thiết gan được tiến hành như sau:
Cân chính xác 0,1 gam mẫu cho vào bình vô cơ hóa, thêm 8ml hỗn hợp axit HNO3 – HClO4(tỷ lệ 1:1) đun ở 1500
C trong vòng 30 phút, sau đó định mức đến 25ml bằng nước cất. Hàm lượng đồng trong mẫu được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật ngọn lửa.
2.4. Trang thiết bị và hoá chất phục vụ nghiên cứu 2.4.1. Trang thiết bị 2.4.1. Trang thiết bị
- Hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS-3300 của hãng Perkin-Elmer.
- Hệ thống nguyên tử hoá bằng ngọn lửa của hãng Perkin-Elmer. - Cân phân tích chính xác đến 0.01mg.
- Máy ly tâm tốc độ tối đa 12.000 vòng/phút. - Tủ lạnh để bảo quản mẫu.
2.4.2. Hoá chất và dụng cụ
Do yêu cầu nghiêm ngặt của phép đo AAS nên nước cất, hoá chất phải có độ tinh khiết cao, được kiểm tra nồng độ nguyên tố bằng phép đo AAS trước khi dùng. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng các loại hóa chất và dụng cụ sau:
2.4.2.1. Hóa chất
- Dung dịch chuẩn đồng 1000 ppm. - Glyxerin.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
25 - NaCl, MgCl2, KCl, CaCl2 tinh khiết. - HCl 12M. HNO3, HClO4.
- Etanol 98%. - Nước cất.
2.4.2.2. Dụng cụ
Ống nghiệm, pipet, bình định mức 50ml, 100ml, giá đựng ống nghiệm, đũa thủy tinh, ống đong…
2.4.3. Chuẩn bị hóa chất và dung dịch chuẩn
1)Dung dịch Na 10g/l: Cân chính xác 2,543gam NaCl pha trong 100ml nước cất.
2) Dung dịch K 10g/l: Cân chính xác 1,9102 gam KCl pha trong 100ml nước cất.
3) Dung dịch Ca 10g/l: Cân chính xác 2,775gam CaCl2 pha trong 100ml nước cất.
4) Dung dich chuẩn Mg 1000mg/l.
5) Dung dịch glyxerin 50%: lấy 50ml glyxerin 100% pha với 50ml nước cất. 6) Dung dịch HCl 6M: lấy 50ml HCl 36,5%(6M) pha với 50ml nước cất. 7) Dung dịch chuẩn đồng nồng độ 10ppm: lấy 1ml Cu 1000ppm cho vào bình định mức 100ml, sau đó định mức với nước cất để được 100 ml dung dịch chuẩn Cu nồng độ 10ppm.
2.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Kết quả thực nghiệm thu được trong quá trình nghiên cứu được xử lý theo các quy luật thống kê để đánh giá sai số, độ lặp lại, độ thu hồi, giới hạn phát hiện…
Phân tích phương sai một yếu tố
Phân tích phương sai là phân tích tác động của các yếu tố qua tham số phương sai; nó được dùng nhiều trong các trắc nghiệm để đánh giá những
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
26
nguồn sai số khác nhau liên quan đến dãy kết quả thí nghiệm. Mục đích của sự phân tích phương sai một yếu tố là đánh giá sự ảnh hưởng của một yếu tố nào đó trên các giá trị quan sát, Yi (i = 1, 2,…, k) [6].
Trong bài toán phân tích phương sai một yếu tố A, k mức thí nghiệm, mỗi mức nghiên cứu làm lặp lại n lần, chuẩn F được dùng để so sánh sự sai khác giữa phương sai các giá trị nghiên cứu do sự thay đổi các mức nghiên cứu với phương sai của sai số nghiên cứu có khác nhau đáng tin cậy hay không. Nếu khác nhau không đáng tin cậy, yếu tố A sẽ ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả thí nghiệm, ngược lại nếu khác nhau đáng tin cậy chứng tỏ yếu tố A có ảnh hưởng tới kết quả nghiên cứu.
Trong nội dung nghiên cứu đề ra, chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố để đánh giá ảnh hưởng của một yếu tố nào đó tới kết quả phân tích. Nội dung của bài toán phân tích phương sai một yếu tố được biểu diễn tóm tắt trong bảng dưới đây:
Yếu tố a1 a2 a3 …. ai … ak 1 Y11 y21 y31 yi1 yk1 2 Y12 y22 y32 yi2 yk2 .… J y1j y2j y3j yij ykj .… N Y1n y2n y3n yin ykn Tổng A1=
n j j y 1 1 A2=
n j j y 1 2 A3=
n j j y 1 3 Ai=
n j ij y 1 Ak=
n j kj y 1Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
27
Bảng 2.1: Bảng quy hoạch thực nghiệm phân tích phƣơng sai một yếu tố Nguồn sai số Bậc tự do Tổng các bình phƣơng Bình phƣơng trung bình Yếu tố A k-1 SSA = SS2-SS3 1 2 k SS S A A
Sai số thí nghiệm k(n-1) = kn – k SSe = SStotal – SSA
) 1 ( 2 n k SS S e e Tổng cộng kn - 1 SStotal = SS1- SS3
Bảng 2.2: Phân tích phƣơng sai một yếu tố
Trong đó:
k i n j ij y SS 1 1 2 1
k i i A n SS 1 2 2 1 2 1 3 1 (
) k i i A kn SSGiả thuyết thống kê:
Giả thuyết không H0 : 2 2
e
A S
S
Giả thuyết khác không Ha : 2 2
E
A S
S
Tính giá trị thống kê F theo công thức sau: Ftính 2 2 e A S S > 1
So sánh Ftính với Fbảng (P, f1, f2), trong đó f1= k-1 là bậc tự do của mức nghiên cứu đã làm; f2= n(k-1) là bậc tự do của số nghiên cứu đã tiến hành trong quy hoạch nghiên cứu.
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong những thập niên gần đây, phương pháp AAS đã được sử dụng khá rộng rãi để xác định kim loại trong các mẫu quặng, đất đá, nước, các mẫu y học, sinh học, các sản phẩm công nghiệp, rau quả, thực phẩm, các nguyên tố vi lượng trong phân bón, thức ăn gia súc. Trong ngành dược cũng đã có một số công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này để xác định kim loại trong dược chất, tá dược.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
28
Để khai thác tính ưu việt về độ chính xác và độ nhạy cao, chúng tôi sẽ ứng dụng kỹ thuật này để xác định đồng trong máu, nước tiểu và sinh thiết gan.
2.5.1. Nguyên tắc của phép đo
Ở điều kiện bình thường nguyên tử không thu và cũng không phát năng
lượng. Nhưng khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái hơi tự do, bị kích thích bằng
chùm tia đơn sắc có năng lượng và bước sóng phù hợp, (được tạo bởi một loại
đèn riêng cho mỗi nguyên tố kim loại) thì chúng sẽ hấp thụ năng lượng của ánh
sáng và sinh ra một loại phổ là phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) của nguyên tố đó
[3,5]. Do đó muốn thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố
cần phải thực hiện các quá trình sau:
1. Chọn các điều kiện và một loại trang bị phù hợp để chuyển mẫu phân tích từ trạng thái ban đầu (rắn hay dung dịch) thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự do. Đó chính là quá trình hoá hơi và nguyên tử hoá mẫu.
2. Chiếu chùm tia bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích qua đám hơi nguyên tử tự do vừa tạo ở trên. Các nguyên tử của nguyên tố cần xác định trong đám hơi sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổ hấp thụ của nó.
3. Tiếp đó, nhờ một hệ thống máy quang phổ người ta thu toàn bộ chùm sáng, phân ly và chọn một vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần phân tích để đo cường độ của nó. Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ. Trong một giới hạn nồng độ nhất định của nồng độ C, giá trị cường độ này phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C của nguyên tố ở trong mẫu phân tích.
Theo định luật Buger - Lamber - Beer: khi chùm tia sáng đơn sắc có cường độ Io được chiếu vào môi trường hấp thụ có độ dài l (cm) chứa No
nguyên tử, sau khi ra khỏi môi trường còn lại cường độ I, thì cường độ của một vạch phổ hấp thụ là:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
29
D = log (Io/I ) = 2,303Kg .l .No
