Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ đồng lần lượt là : 0; 0,2; 0,4; 0,6; 1; 1,2; 1,5mg/l trong nước cất. Sau đó tiến hành đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng theo các điều kiện tối ưu đã lựa chọn. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ đồng được đưa ra ở hình 3.9.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
45
Hình 3.9: Đƣờng chuẩn xác định đồng trong nƣớc tiểu
Đường chuẩn trên hình 3.9 có hệ số tương quan 0.99969 độ dốc là 0,0650 và tuyến tính đến 1,5mg/l.
Hàm lượng đồng trong mẫu sinh thiết gan sau khi đã xử lý và mẫu nước tiểu được phân tích dựa trên đường chuẩn.
3.4. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp
Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được, nồng độ này lớn hơn mẫu trắng với độ tin cậy là 99%.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định giới hạn phát hiện bằng phương pháp đo lặp lại 7 lần mẫu dung dịch chuẩn đồng có nồng độ 0,2mg/l trong nền glyxerin 10% đối với mẫu huyết thanh và trong nền nước cất đối với mẫu nước tiểu và sinh thiết gan. Các điều kiện xác định như khi lập đường chuẩn, chấp nhận sự sai khác như khi lập đường chuẩn và mẫu trắng là không đáng kể. Kết quả được đưa ra trong bảng 3.9 và 3.10:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
46
Bảng 3.9: Kết quả phân tích mẫu chuẩn đồng nồng độ 0,2mg/l trong nền glyxerin 10% STT Hàm lƣợng đồng(mg/l) Độ thu hồi (%) 1 0,191 95,5 2 0,197 98,5 3 0,209 104,5 4 0,205 102,5 5 0,208 104,0 6 0,175 87,5 7 0,175 87,5 TB 0,194 97,0 Từ các kết quả trên ta có: - Giá trị trung bình: 0,194. - Độ lệch chuẩn (S): 0,0146. - Bậc tự do (n-1): 6.
- Giá trị t tra bảng với bậc tự do là 6 và độ tin cậy 99%: 3,143. - Giới hạn phát hiện:
(GHPH): GHPH = S (x) t = 0,0146 x 3,143 = 0,046
Bảng 3.10: Kết quả phân tích mẫu chuẩn đồng nồng độ 0,2mg/l trong nền nƣớc cất STT Hàm lƣợng đồng(mg/l) Độ thu hồi (%) 1 0,204 102,0 2 0,215 107,5 3 0,198 99,0 4 0,197 98,5 5 0,212 106,0 6 0,204 102,0 7 0,218 109,0
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 TB 0,207 103,5 Từ các kết quả trên ta có: - Giá trị trung bình: 0,207. - Độ lệch chuẩn (S): 0,0083. - Bậc tự do (n-1): 6.
- Giá trị t tra bảng với bậc tự do là 6 và độ tin cậy 99%: 3,143 Giới hạn phát hiện (GHPH): GHPH = S x t = 0,0083 x 3,143 = 0,026
Như vậy giới hạn phát hiện của phương pháp khi phân tích đồng trong mẫu huyết thanh là 0,046mg/l và trong mẫu nước tiểu, sinh thiết gan là 0,026mg/l.
3.5. Đánh giá phƣơng pháp phân tích 3.5.1. Độ lặp lại
Độ lặp lại của phương pháp phân tích hàm lượng đồng được đánh giá trên các mẫu huyết thanh và nước tiểu có hàm lượng đồng khác nhau. Phép phân tích được thực hiện 10 lần trên mỗi mẫu để tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và hệ số biến động. Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.11;
Bảng 3.11: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp
Loại mẫu Giá trị trung bình Độ lệch chuẩn Hệ số biến động (%)
Huyết thanh 0,818 0,017 2,06
Nƣớc tiểu 0,522 0,009 1,40
Kết quả ở bảng trên cho thấy phương pháp phân tích có độ lặp lại tốt, hệ số biến động nhỏ với cả mẫu huyết thanh và mẫu nước tiểu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
48
3.5.2. Độ chính xác
Độ chính xác của phương pháp được đánh giá qua việc phân tích mẫu huyết thanh chuẩn NIST SMR 1598 (Inorganic Constituents in Bovine Serum), kết quả phân tích được đưa ra ở bảng 3.12
Bảng 3.12: Kết quả phân tích mẫu chuẩn Loại mẫu chuẩn Hàm lƣợng đồng Độ thu hồi (%) Giá trị chứng chỉ (X±SD) Kết quả phân tích (X±SD, n=7) NIST SMR 1598 0,72 ± 0,026 0,74 ± 0,03 102,77
Kết quả mẫu chuẩn cho thấy phương pháp có độ chính xác cao, độ thu
hồi của đồng là 102,77%, đáp ứng được yêu cầu phân tích hàm lượng đồng
trong các mẫu sinh học.
3.5.3. Xác định hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp phân tích
Để đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình xác định hàm lượng đồng trong huyết thanh và nước tiểu chúng tôi tiến hành phân tích mẫu huyết thanh, mẫu nước tiểu sau đó đem thêm vào mẫu một lượng chính xác đồng chuẩn.
3.5.3.1. Hiệu suất thu hồi với mẫu huyết thanh
Để đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp xác định hàm lượng đồng trong huyết thanh, chúng tôi sử dụng 1ml mẫu huyết thanh, sau đó thêm 0,1ml dung dịch chuẩn đồng nồng độ 10 mg/l, lượng đồng được thêm vào 1µg, tương ứng với nồng độ trong thể tích 1,1 ml là 0,909 mg/l đồng. Hiệu suất thu hồi được đưa ra ở bảng 3.13.
Bảng 3.13: Kết quả phân tích đánh giá hiệu suất thu hồi đồng trong huyết thanh
STT Mẫu chƣa thêm đồng (mg/l)
Mẫu thêm đồng
0,909 (mg/l) Độ thu hồi (%)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 2 1,20 2,04 92,4 3 1,16 2,06 99,0 4 1,14 1,98 92,4 5 1,18 2,00 90,2 Trung bình 1,18 2,036 94,16
Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy hiệu suất thu hồi đồng đối với mẫu huyết thanh đạt 94,16% và đáp ứng được yêu cầu của phép phân tích vết.
3.5.3.2. Hiệu suất thu hồi đối với mẫu nƣớc tiểu
Hiệu suất thu hồi của phương pháp xác định đồng trong nước tiểu, được đánh giá trên mẫu nước tiểu của bệnh nhân Wilson. Lấy 0,25 ml dung dịch chuẩn đồng nồng độ 10 mg/l thêm vào thêm 4,75ml nước tiểu, lượng đồng được thêm vào là 2,5µg trong thể tích là 5 ml, tương ứng với lượng đồng thêm vào có nồng độ 0,5mg/l. Kết quả được đưa ra ở bảng 3.14:
Bảng 3.14: Kết quả phân tích đánh giá hiệu suất thu hồi đồng trong nƣớc tiểu
STT Mẫu chƣa thêm đồng(mg/l) Mẫu thêm Cu 0,5 (mg/l) Độ thu hồi (%) 1 0,367 0,835 93,6 2 0,352 0,841 97,8 3 0,354 0,809 91,0 4 0,334 0,818 96,8 5 0,329 0,828 99,8 Trung bình 0,348 0,826 95,6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
50
Kết quả ở bảng 3.14 cho thấy hiệu suất thu hồi đồng đối với mẫu nước tiểu đạt 95,6% và đáp ứng được yêu cầu của phép phân tích vết.
3.6. Xây dựng quy trình phân tích kim loại đồng trong máu và nƣớc tiểu
Dưạ vào các kết quả khảo sát ở trên quy trình phân tích được đề nghị để xác định hàm lượng đồng trong máu và nước tiểu như sau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
51
Mẫu máu
( lấy qua tĩnh mạch vào buổi sáng)
Li tâm (tách TP hữu hình) Huyết Thanh
Pha loãng với nước cất (Tỉ lệ 1:1)
Dung dịch phân tích
Đo trên máy AAS-3300 của hãng Perkin-Elmer.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
52
Mẫu nước tiểu
( lấy trong 24 giờ)
Trộn đều (ghi thể tích tổng số)
Dung dich phân tích
lấy 10ml vào bình teflon Mẫu phân tích
Đo trên máy AAS-3300 của hãng Perkin-Elmer.
Hình 3.11: Quy trình phân tích hàm lƣợng đồng trong nƣớc tiểu 3.7. Kết quả phân tích và đánh giá trên các mẫu thực
3.7.1. Kết quả nghiên cứu trên mẫu nhóm đối chứng
3.7.1.1. Mẫu huyết thanh
Để xác định hàm lượng đồng huyết thanh của người bình thường và đánh giá sự khác biệt theo lứa tuổi, giới tính, chúng tôi tiến hành lấy mẫu theo các nhóm đối tượng sau:
Nhóm 1: Lứa tuổi dưới 18. Nhóm 2: Lứa tuổi từ 18 đến 30. Nhóm 3: Lứa tuổi từ 31 đến 40. Nhóm 4: Lứa tuổi từ 41 đến 59. Nhóm 5: Lứa tuổi từ 60 đến 74.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
53 Nhóm 6: Lứa tuổi từ 75 trở lên.
Các đối tượng là các thanh thiếu niên, cán bộ đang công tác, đang sống và làm việc tại Hà Nội. Các đối tượng vẫn sinh hoạt và làm việc bình thường, không có bất kỳ biểu hiện của bệnh trong quá trình khám sức khỏe. Các đối tượng được lấy mẫu máu tĩnh mạch vào buổi sáng, lúc đói để định lượng đồng huyết thanh. Tổng số đối tượng là 1000 người trong đó có 646là nam và 354 là nữ.
Lấy mẫu huyết thanh được bảo quản trong tủ lạnh, khi tiến hành phân tích được rã đông tự nhiên, sau đó mẫu được pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:1. Hàm lượng đồng trong huyết thanh được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật ngọn lửa. Kết quả phân tích được đưa ra ở bảng 3.15;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
54
Bảng 3.15 : Kết quả phân tích hàm lƣợng đồng trong huyết thanh nhóm đối chứng
Nhóm Lứa tuổi Giới tính Số mẫu Hàm lƣợng đồng (mg/l) X ± SD 1 Dưới 18 Nam 39 0,90±0,17 Nữ 40 0,91±0,13 2 18-30 Nam 200 0,95±0,21 Nữ 88 1,12±0,31 3 31-44 Nam 153 0,99±0,29 Nữ 131 1,27±0,28 4 45-59 Nam 49 1,09±0,35 Nữ 69 1,31±0,32 5 60-74 Nam 35 1,17±0,33 Nữ 16 1,35±0,31 6 Trên 75 Nam 170 1,23±0,35 Nữ 10 1,40±0,34 7 Tổng Nam 646 1,05±0,30 Nữ 354 1,22±0,33
Kết quả khảo sát của hàm lượng đồng huyết thanh cho thấy: giá trị trung bình đối với nam là 1,05mg/l và độ lệch chuẩn 0,30mg/l, đối với nữ là 1,22mg/l và độ lệch chuẩn là 0,33mg/l. Hàm lượng đồng huyết thanh ở nam thấp hơn nữ ở có ý nghĩa thống kê với P < 0,001 và có sự tăng hàm lượng đồng theo tuổi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
55
Về sự mối liên hệ của đồng huyết thanh theo tuổi, kết quả nghiên cứu cho thấy từ 45 tuổi trở lên đồng huyết thanh tăng có ý nghĩa thống kê so với tất cả các nhóm tuổi khác. Sự tăng của đồng huyết thanh theo tuổi cũng được nhiều tác giả đề cập, các nghiên cứu của DrugueM năm 1984 cho thấy đồng huyết thanh của nhóm người khoẻ mạnh trên 60 tuổi có giá trị trung bình là 1,50mg/l cao hơn so với nhóm tuổi trưởng thành là 1,07mg/l. Nghiên cứu của Jolnson năm 1992 [18], về khả năng hấp thu, chuyển hoá và thời gian bán huỷ sinh học của đồng cũng cho thấy có sự tăng hàm lượng đồng trong huyết thanh cùng với sự tăng của tuổi tác. Lý giải về sự tăng hàm lượng đồng các tác giả cho rằng có sự thay đổi cấu trúc của Ceruloplasmin ở người có tuổi, bình thường Ceruloplasmin là một oxygen oxidoreductase được tổng hợp ở gan có chứa 6 nguyên tử đồng hoá trị II trong cấu trúc bởi liên kết SH, khi nghiên cứu bằng phổ cộng hưởng từ điện tử cho thấy sự tồn tại đồng hoá trị I trong cấu trúc của Ceruloplasmin tăng do vậy số nguyên tử đồng tăng trong cấu trúc của Ceruloplasmin dẫn đến tăng hàm lượng đồng huyết thanh.
Về mối liên hệ giữa đồng huyết thanh và giới tính cho thấy hàm lượng đồng huyết thanh ở nữ cao hơn ở nam có ý nghĩa thống kê. Sự tăng hàm lượng đồng huyết thanh ở nữ cũng được nhiều tác giả đề cập[17,22] nguyên nhân tăng hàm lượng đồng ở nữ được các tác giả cho rằng do hàm lượng estrogen ở nữ cao làm tăng quá trình tổng hợp ceruloplasmin ở gan, dẫn tới tăng hàm lượng đồng huyết thanh.
3.7.1.2. Mẫu nƣớc tiểu
Để xác định hàm lượng đồng trong nước tiểu, chúng tôi lấy mẫu nước tiểu trong 24 giờ của người bình thường và tiến hành đo hàm lượng đồng bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử dựa trên đường chuẩn đã được thiết lập.
Kết quả phân tích đồng trong mẫu nước tiểu đối chứng được đưa ra ở bảng 3.16:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
Bảng 3.16: Kết quả phân tích hàm lƣợng đồng trong nƣớc tiểu nhóm đối chứng
Nhóm Lứa tuổi Giới tính Số mẫu Hàm lƣợng đồng (mg/l) X ± SD 1 Dưới 18 Nam 32 <0,026 Nữ 19 <0,026 2 18-30 Nam 50 <0,026 Nữ 45 <0,026 3 31-44 Nam 48 <0,026 Nữ 53 <0,026 4 45-59 Nam 40 <0,026 Nữ 43 <0,026 5 60-74 Nam 20 <0,026 Nữ 15 <0,026 6 Trên 75 Nam 41 <0,026 Nữ 27 <0,026 7 Tổng Nam 231 <0,026 Nữ 202 <0,026
Kết quả trên cho thấy hàm lượng đồng trong nước tiểu của người bình
thường nhỏ hơn 0,026mg/l, không có sự khác nhau về giới tính và độ tuổi.
Hàm lượng đồng trong nước tiểu ở người bình thường đã được nhiều tác giả
nghiên cứu [2,22,16]. Nguyên nhân hàm lượng đồng trong nước tiểu ở người
bình thường thấp là do lượng đồng đi vào cơ thể kết hợp với α-2Globulin tạo
thành Ceruloplasmin đi vào máu, lượng đồng còn dư nhờ cân bằng nội môi
không thải qua nước tiểu mà thải qua mật.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
57
3.7.1.3. Mẫu sinh thiết gan
Trong các chỉ số sinh học để chẩn đoán bệnh Wilson, sinh thiết gan là một chỉ số vàng để chẩn đoán chính xác nguyên nhân gây bệnh[15,16], tuy nhiên việc lấy mẫu sinh thiết gan tại Việt Nam còn rất khó khăn và phức tạp, chủ yếu là do tâm lý của người bệnh. Trong khi đó, trên thế giới, mẫu sinh thiết gan là một trong những chỉ số bắt buộc cần phải phân tích và đánh giá trước khi điều trị bệnh, do mẫu sinh thiết gan thể hiện được tốc độ và hệ số tích lũy của đồng theo thời gian từ đó sẽ đưa ra được phác đồ điều trị chính xác nhất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ sử dụng được một mẫu gan của bệnh nhân ghép gan 9 tuổi, chỉ số phân tích về máu và nước tiểu cũng như các xét nghiệm cận lâm sàng khác cho thấy bệnh nhân không có biểu hiện mắc bệnh Wilson. Mẫu gan được sấy khô sau đó tiến hành vô cơ hóa theo quy trình đã mô tả ở mục 2.3.3. Kết quả phân tích được đưa ra ở bảng 3.17:
Bảng 3.17: Kết quả phân tích hàm lƣợng đồng trong mẫu sinh thiết gan nhóm đối chứng
Tên mẫu Hàm lƣợng đồng
Mẫu sinh thiết gan 21,5µg/g
Kết quả phân tích ở bảng 3.17 cho thấy hàm lượng đồng trong sinh thiết gan nhỏ hơn kết quả nghiên cứu của mẫu bệnh nhân nữ gép gan 12 tuổi mà nhóm tác giả Vũ Đức Lợi đã công bố trước đây [2], hàm lượng đồng trong sinh thiết gan của bệnh nhân này có giá trị là 91,2 µg/g. Các kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Kern L. Nuttall của Canada [20] khi nghiên cứu trên 141 sinh thiết gan bao gồm 103 mẫu sinh thiết gan của người trưởng thành và 38 mẫu sinh thiết gan của trẻ em, kết quả cho thấy giá trị trung bình của đồng trong gan là 55 µg/g, giá trị thấp nhất là 7 µg/g và cao nhất là 147 µg/g, tác giả cũng đưa ra đề xuất khi hàm lượng đồng trong mẫu sinh thiết gan vượt quá 200 µg/g thì cần phải xem xét và đánh giá nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến gan và bệnh Wilson [15,16,20].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
58
3.7.2. Kết quả nghiên cứu trên các bệnh nhân Wilson
3.7.2.1. Kết quả nghiên cứu trong quá trình chẩn đoán bệnh
Do Wilson là một bệnh mới xuất hiện và số người phát hiện ở Việt Nam chưa nhiều nên việc lấy mẫu là rất khó khăn.
Khi bệnh nhân được nghi ngờ mắc bệnh Wilson, để chẩn đoán bệnh, ngoài các chỉ số cận lâm sàng như chỉ số về thần kinh, chức năng gan, vòng Keyer-Fleischer ở mắt, thì hàm lượng đồng trong nước tiểu, huyết thanh và mẫu sinh thiết gan là cũng là các chỉ số quan trọng để chẩn đoán và điều trị bệnh. Khi hàm lượng đồng trong nước tiểu lớn hơn so với người bình thường và vượt giá trị 0,2mg/24 giờ thì bệnh nhân đó được xác định chính xác bệnh là
