Thuốc BAL là viết tắt của British anti-Lewisite được nghiên cứu bởi nhà sinh hóa người Anh trong chiến tranh thế giới thế hai là loại thuốc dùng để giải độc các hợp chất Lewisite là ký hiệu của các dạng hợp chất asen hữu cơ, đặc biệt là asen, đây là các chất độc được sử dụng trong các loại vũ khí hóa học, hiện nay BAL cũng được sử dụng nhiều để giải độc các kim loại nặng như Hg, Pb.. và điều trị bệnh Wilson. Hoạt chất của thuốc BAL là 2,3 dimercapto propanol có công thức hóa học là C3H8S2O, trong phân tử có chứa hai nhóm thiol (SH), nó liên kết với kim loại nặng thông qua cầu lưu huỳnh tạo ra các chất ít độc hơn. BAL được dùng dưới dạng dung dịch dầu tiêm bắp, có hiệu quả sau 30 phút đến 1 giờ, trong vòng 4 giờ sẽ thải trừ hết qua thận, nên cứ 4 giờ tiêm một lần trong trường hợp ngộ độc cấp (với liều 3 - 5 mg/kg thể trọng) hay dùng hàng ngày trong 2 - 3 tuần (với liều 3mg/kg thể trọng) sẽ không sợ tích lũy. Tuy nhiên ở liều cao hơn liều điều trị thì BAL có thể gây buồn nôn, nôn, nhức đầu, tăng huyết áp, liều cao hơn nữa có thể gây hôn mê. Riêng trẻ em có thể bị sốt, giảm bạch cầu trung tính tạm thời. Phải hết sức cẩn thận với người có chức năng gan không bình thường. Chỉ dùng cho phụ nữ có thai trong trường hợp ngộ độc cấp tính, có nguy cơ đe dọa tính mạng.. Sự kết hợp của nguyên tố đồng trong máu với BAL tạo thành phức sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 14 H2C CHCH2OH S S Cu S S H2C CHCH2OH
Phức này cũng được bài tiết qua đường nước tiểu. Ngoài ra còn có thể dùng Sulphat kẽm với liều lượng 100-300mg/ngày. Trường hợp tối cấp cần phải ghép gan.
1.4. Các phƣơng pháp phân tích đồng trong các mẫu sinh học
Hiện nay có nhiều phương pháp nhạy và chọn lọc để phân tích hàm lượng đồng trong các mẫu sinh học như: phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), phương pháp phổ phát xạ nguyên tử(AES), phương pháp kích hoạt nơtron(NAA), phương pháp phổ khối lượng kết hợp với nguồn cảm ứng cao tần plasma (ICP-MS), phương pháp chiết trắc quang và phương pháp điện hóa [1,8,9,10,14,24,25,26].
1.4.1. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử
Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử là phương pháp phổ biến nhất hiện nay để phân tích đồng trong các mẫu sinh học, phương pháp này có ưu việt là quá trình xử lý mẫu đơn giản, độ nhạy và độ chọn lọc cao. Các kĩ thuật nguyên tử hóa thường được sử dụng là kĩ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa và lò graphit. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kĩ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa để phân tích đồng trong các mẫu huyết thanh, nước tiểu và sinh thiết gan [10,22,25,16].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
15
1.4.2. Phƣơng pháp quang phổ phát xạ, phổ khối lƣợng kết hợp nguồn cảm ứng cao tần plasma (ICP-MS)
Hiện nay việc xác định hàm lượng đồng trong các mẫu sinh học đã được nhiều tác giả trên thế giới đề cập, phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử sử dụng nguồn cảm ứng cao tần plasma (ICP-OES) được sử dụng tương đối phổ biến đối với các mẫu tóc và mô, tuy nhiên đối với mẫu huyết thanh và nước tiểu, phương pháp này có nhược điểm là sự ảnh hưởng của thành phần nền trong mẫu do độ nhớt của dung dịch lớn cũng như ảnh hưởng của các nguyên tố đi kèm, đặc biệt là ảnh hưởng của K và Na đến phép đo của đồng. Để khắc phục ảnh hưởng trên, tác giả thường tiến hành vô cơ hóa mẫu và chiết tách đồng ở dạng phức sau đó chiết bằng các dung môi hữu cơ để loại bỏ thành phần nền.
Phương pháp phổ khối lượng sử dụng nguồn cảm ứng cao tần plasma (ICP-MS) là phương pháp hiện đại nhất để xác định các nguyên tố vết trong các mẫu sinh học, tuy nhiên chỉ có một số ít công trình sử dụng phương pháp này để phân tích hàm lượng đồng trong huyết thanh và nước tiểu. Nguyên nhân là do sự ảnh hưởng của quá trình hình thành đa nguyên tử có số khối trùng với số khối của nguyên tố phân tích. Đối với 63Cu+ ¶nh h-ëng do sù h×nh thµnh cña (40 Ar23Na+), với 65Cu+ ( 48Ca17O+, 33S32S+, 32S17O16O+ ), với 75 As+ (40Ar35Cl+), với 56Fe+ (40Ar16O+ và 40Ca16O+), 57Fe+(40Ar16O1H+ và 40 Ca16O1H+), 64Zn+(40Ar24 Mg+ và 36Ar12C16O+) và 66Zn+(40Ar26Mg+ và 132Ba++), mặt khác thành phần mẫu huyết thanh và nước tiểu rất phức tạp, các nguyên tố Ca, Mg, Na, K, S có nồng độ lớn hơn nhiều các nguyên tố cần phân tích nên ICP-MS mặc dù là phương pháp rất hiện đại nhưng không được sử dụng nhiều để phân tích nguyên tố đồng trong các mẫu sinh học [13,25].
1.4.3. Phƣơng pháp kích hoạt nơtron
Phương pháp kích hoạt nơtron đã được ứng dụng để phân tích đồng trong các mẫu sinh học từ năm 1964, nguyên tắc của phương pháp là sử dụng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
16
chùm nơtron kích hoạt vào mẫu, sau đó bức xạ gama được giải phóng bởi Cu64
, phương pháp này có độ nhạy cao tuy nhiên ảnh hưởng của Fe59
và Co60 là rất lớn nên phương pháp này ít được sử dụng để phân tích đồng trong các mẫu sinh học[13,22].
1.4.4. Phƣơng pháp điện hóa
Để xác định Cu trong các mẫu sinh học tác giả Alireza Mohadesi, Ashraf và cộng sự đã sử dụng phương pháp vol-ampe hòa tan xung vi phân anốt. Mẫu được vô cơ hóa bằng phương pháp vô cơ hóa khô, sau đó tiến hành hòa tan trong axit nitric đặc. Phép đo điện hóa dựa trên nguyên tắc tạo phức của đồng với Nitroso-R trên bề mặt điện cực. Đầu tiên Pyrrole được polyme hóa trong sự có mặt của Nitroso-R. Màng polypyrrole (OPPy) đã được biến tính với Nitroso-R phủ trên bề mặt điện cực nền platin phản ứng với Cu(II) trong môi trường pH trung tính để hình thành phức. Quá trình tạo phức giữa Nitroso-R và Cu(II) cho phép làm giàu Cu(II) từ các dung dịch mẫu trên bề mặt điện cực. Sau đó tiến hành đo von-ampe hòa tan anốt trong nền đệm axetat, pic hòa tan của đồng được đo tại thế +0,08 V. Khoảng tuyến tính của phép đo được xác định trong khoảng từ 1,2 tới 243,9 ng mL-1
và giới hạn phát hiện là 0,7 ng.mL-1. Phương pháp này được sử dụng để xác định các ion Cu trong các sinh học. Kết quả cho thấy khả năng áp dụng phương pháp để xác định các ion này trong các mẫu thực [9].
Tuy nhiên, phương pháp này có nhiều nhược điểm do sự có mặt của các chất ảnh hưởng. Sự có mặt của các ion khác có khả năng tạo phức với Nitroso- R có thể ảnh hưởng tới quá trình tạo phức của Cu(II) do sự cạnh tranh các vị trí tạo phức của Nitroso-R trên màng OPPy. Khi quy trình trên được áp dụng với sự có mặt của 500 µg L-1
Co(II), Hg(II), Ag(I), Ni(II), và Fe(III) làm suy giảm peak của Cu(II) lần lượt 10, 13, 17, 9 và 21%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
17
1.4.5. Phƣơng pháp đo quang
Phương pháp chiết trắc quang đã được tác giả Ramon E.Stoner đề xuất từ năm 1963 để xác định đồng trong mẫu sinh học. Mẫu được vô cơ hóa bằng hỗn hợp axit nitric và perchloric sau đó đồng được tạo phức với diphenylcarbazid trong môi trường kiềm và chiết trong benzen. Mật độ quang của phức được đo tại bước sóng 450 nm. Phương pháp này có thể xác định được hàm lượng đồng đến nồng độ ppm, tuy nhiên ảnh hưởng của các nguyên tố đi kèm trong các mẫu sinh học như Fe, Mn và Hg sẽ cạnh tranh tạo phức và làm giảm hàm lượng của đồng, mặt khác thời gian phân tích mẫu kéo dài và độ lặp lại của phương pháp thấp hơn so với phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử, nên hiện nay phương pháp này ít được sử dụng để phân tích đồng trong các mẫu sinh học [2,22].
1.5. Các phƣơng pháp xử lý mẫu sinh học
Để xác định hàm lượng đồng trong các mẫu sinh học, mẫu cần phải vô cơ hoá mẫu trước khi phân tích. Một số phương pháp ôxy hoá đã được nghiên cứu, phần lớn sử dụng các axit có tính ôxy hoá hoặc persulfat. Tuy nhiên việc đánh giá hiệu quả của quá trình ôxy hoá vẫn ít được thực hiện. Để quá trình ôxy hoá triệt để, người ta thường sử dụng tác nhân ôxy hoá là hỗn hợp các axit sulfuric và nitric, hoặc hỗn hợp axit sulphuric, nitric và percloric hay hydro peroxit. Tro hoá khô với magie oxit hay magie nitrat đã được áp dụng hiệu quả trong phân tích các mẫu sinh học khác nhau [ 1,3,26].
Các phương pháp xử lý mẫu được chia làm 3 nhóm chính: tro hóa khô trong các lò nung ở nhiệt độ cao, vô cơ hóa ướt ở áp suất khí quyển và vô cơ hoá trong lò vi sóng ở áp suất cao [1,21 ]. Quá trình ôxy hoá vẫn ít được thực hiện . Để quá trình ôxy hoá triệt để, người ta thường sử dụng tác nhân ôxy hoá là hỗn hợp các axit sulfuric và nitric, hoặc hỗn hợp axit sulphuric, nitric và percloric hay hydro peroxit. Tro hoá khô với magie oxit hay magie nitrat đã được áp dụng hiệu quả trong phân tích các mẫu sinh học khác nhau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
18
Các phương pháp xử lý mẫu được chia làm 3 nhóm chính: Vô cơ hóa khô trong các lò nung ở nhiệt độ cao, vô cơ hóa ướt ở áp suất khí quyển và vô cơ hoá trong lò vi sóng ở áp suất cao [1 ].
1.5.1. Kỹ thuật vô cơ hoá khô
Nguyên tắc: Vô cơ hoá khô là kỹ thuật nung để xử lý mẫu trong lò nung ở một nhiệt độ thích hợp, song thực chất đây chỉ là bước đầu tiên của quá trình xử lý mẫu vì sau khi nung tro mẫu phải được hòa tan (xử lý tiếp) bằng dung dịch muối hay axit phù hợp để chuyển các chất phân tích vào dạng dung dịch. Việc tro hoá thường được bổ sung thêm chất phụ gia bảo vệ hay chất chảy để làm giảm nhiệt độ nóng chảy của mẫu và bảo vệ các nguyên tố phân tích không bị mất trong quá trình xử lý mẫu [1,4].
Trong quá trình nung xử lý mẫu có thể có các quá trình vật lý và hoá học sau đây xảy ra:
- Sự bay hơi làm mất nước hấp thụ và nước kết dính trong chất mẫu - Tro hoá, đốt cháy các chất hữu cơ của mẫu
- Phá vỡ cấu trúc ban đầu của mẫu
- Chuyển dạng các hợp chất phức tạp của mẫu về dạng đơn giản (từ dạng hữu cơ sang vô cơ)
- Quá trình ôxy hoá khử thay đổi hoá trị của nguyên tố trong mẫu - Giải phóng ra một số khí như CO, CO2, SO2, ....
- Có một số tương tác hoá học của các chất với nhau, tương tác với chất phụ gia thêm vào, ... tạo thành các chất lúc đầu không có.
Đối với phân tích hàm lượng các kim loại không bay hơi trong các mẫu có hàm lượng hữu cơ cao, tro hoá khô là một phương pháp tương đối đơn giản để phá vỡ các chất hữu cơ và không tốn nhiều thời gian. Nhược điểm chính của kỹ thuật này là khả năng mất một số nguyên tố phân tích do sự bay hơi hay nhiễm bẩn mẫu bởi bụi trong không khí và sự hấp phụ chất lên chén đựng mẫu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
19
[3]. Nhiều tác giả đã sử dụng kỹ thuật tro hoá khô để xử lý mẫu sinh học nhằm xác định hàm lượng đồng, kẽm, sắt trong mẫu tóc và máu người. Mẫu được cho vào chén thạch anh và đun nhẹ ở nhiệt độ thấp. Sau đó đặt vào lò nung ở 500oC trong 3 giờ. Tro nung được làm ẩm với 0,5 ml nước, sau đó thêm lần lượt 0,5 ml HNO3 và 0,5 ml HClO4 đặc, tiếp tục đun ở 200oC. Tro ẩm được xử lý tiếp với 0,5 ml HNO3 đặc và nước sau đó đun nhẹ cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt. Độ thu hồi khi phân tích các nguyên tố trong mẫu tóc nằm trong khoảng 94 – 108%.
1.5.2. Kỹ thuật vô cơ hoá ƣớt ở áp suất khí quyển
Nguyên tắc: Dùng axit mạnh (ví dụ HCl, H2SO4), hay axit mạnh và có tính ôxy hoá (HNO3, HClO4) hoặc hỗn hợp 2 axit (HNO3 + H2SO4), 3 axit (HNO3 + H2SO4 + HClO4) để phân huỷ mẫu trong điều kiện đun nóng trong bình Kendan, trong cốc thuỷ tinh(hệ hở). Lượng axit thường gấp 10-15 lần lượng mẫu. Thời gian xử lý mẫu thường từ vài giờ đến vài chục giờ [3]. Axit nitric thường được sử dụng nhiều nhất vì nó không tạo thành các muối không tan trong quá trình vô cơ hoá mẫu như HCl và H2SO4. Hydro peroxit H2O2 cũng có thể được thêm vào để tăng khả năng ôxy hoá [1,4]. Các tác nhân phân huỷ mẫu trong quá trình này gồm: tác dụng phá huỷ các hạt mẫu của axit đặc và tác nhân phá huỷ mẫu của năng lượng nhiệt khi đun sôi mẫu. Các tác nhân này bào mòn dần các hạt mẫu từ ngoài vào, làm cho các hạt mẫu bị mòn dần rồi tan hết.
Tuy tương đối đơn giản và không đắt tiền, xử lý mẫu trong cốc hở hay bình Ken dan được sử dụng nhiều trong việc xử lý các mẫu sinh học, mặc dù thời gian phân hủy mẫu bị kéo dài.
1.5.3. Vô cơ hoá mẫu trong lò vi sóng áp suất cao
Phân huỷ mẫu trong hệ kín lò vi sóng có nhiều ưu điểm hơn hệ hở. Các ống đựng mẫu được làm bằng vật liệu polyme chịu áp suất cao, bền với các tác động hoá học, ít chứa các kim loại gây nhiễm bẩn hơn các cốc thuỷ tinh hay
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
20
chén sứ. Vì các ống đựng mẫu được đậy kín nên loại trừ được sự nhiễm bẩn từ không khí, giảm sự bay hơi nên tốn ít axit. Các ống kín cũng loại trừ được sự mất các kim loại dễ bay hơi có thể xảy ra đối với các hệ hở, đặc biệt trong tro hoá khô. Bộ phận điều khiển điện tử ở các lò vi sóng hiện đại giúp việc xử lý mẫu có độ lặp lại cao. Hơn nữa áp suất cao cho phép phân huỷ
hoàn toàn mẫu tóc một cách nhanh chóng [3,22,26].
Trong lò vi sóng, ngoài hai tác nhân phân huỷ mẫu là tác dụng phá huỷ các hạt mẫu của axít đặc và của năng lượng nhiệt, còn có sự phá vỡ từ trong lòng hạt mẫu ra ngoài do các phân tử nước hấp thụ (>90%) năng lượng vi sóng, chúng có chuyển động nhiệt rất lớn làm căng và xé các hạt mẫu từ trong ra. Hơn nữa, việc vô cơ hoá được thực hiện trong hệ kín, áp suất cao nên nhiệt độ sôi cao hơn thúc đẩy quá trình phá huỷ mẫu rất nhanh và đây là tác nhân phá huỷ mạnh nhất. Vì thế việc xử lý mẫu trong lò vi sóng chỉ cần thời gian ngắn (50 – 70 phút) mà rất triệt để [26 ]. Tuy nhiên rất ít công trình sử dụng kỹ thuật này để phân tích đồng trong huyết thanh và nước tiểu.
1.5.4. Kỹ thuật pha loãng và thay đổi thành phần nền
Để phân tích hàm lượng đồng trong huyết thanh và nước tiểu, nhóm tác giả Felix WS [14] đã sử dụng kỹ thuật pha loãng mẫu và chuẩn bị thành phần nền của dung dịch chuẩn giống như thành phần nền của mẫu và xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian thực hiện nhanh, có thể thực hiện phân tích mẫu hàng loạt. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng cho đối tượng là mẫu huyết thanh và nước tiểu, đối với mẫu máu tổng số và các loại dịch sinh học khác không thể áp dụng đựơc. Mặt khác khi sử dụng các phương pháp phân tích khác như đo quang, điện hóa.. thì mẫu cần thiết phải vô cơ hóa theo các kỹ thuật vô cơ hóa khô hoặc vô cơ hóa ướt được đề cập ở các mục trên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn