2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.5.1. Nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần trên thế giới
Phương pháp chọn tạo khoai tây truyền thống nhờ kỹ thuật lai tạo, lai hồi giao (back cross), ựột biến và chọn lọc (Kuckuck et al, 1985) vấp
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 20
phải những khó khăn về mặt ựặc tắnh di truyền của kỹ thuật trồng trọt (Solanum tubersosum). đó là bộ genom của khoai tây trồng trọt ở thể tứ bội tetraploid (2n=4x = 48 nhiễm sắc thể), gây ra sự phân ly sau lai tạo với một quần thể rất lớn, rất phức tạp, ựòi hỏi quá trình chọn lọc rất nhiều công sức. Quá trình này ựòi hỏi tối thiểu 10 năm ựể có ựược một giống lai ra ựờị Ngoài ra, nhiều ựặc tắnh chống chịu do nhiều gen quy ựịnh sẽ có thể mất dần trong quá trình chọn lọc ở các thế hệ tiếp saụ [37].
Phương pháp chuyển gen ựược coi là chiến lược mới ựể cải tiến các giống cây trồng. Tuy nhiên, nhiều tắnh trạng nông sinh học quan trọng không thể chuyển vào cây trồng bằng công nghệ gen do chúng ựược kiểm soát bởi ựa gen; hoặc các gen kiểm soát các tắnh trạng mong muốn vẫn chưa ựược biết ựến; hoặc các gen của chúng chưa thể tách ra ựược và nhân dòng thành công. Do ựó, phương pháp lai tạo giữa các loài có quan hệ gần gũi bằng dung hợp tế bào trần là một phương pháp thú vị ựể khắc phục những nhược ựiểm trên. Phương pháp dung hợp tế bào trần ựã giải thắch cơ sở di truyền của tắnh kháng với các stress vô sinh và hữu sinh ở cây trồng (McGrath và cộng sự, 2002). [40].
Sơ ựồ tạo giống khoai tây nổi tiếng của Wenzel (1979) bằng dung hợp tế bào trần bao gồm các khâu: chọn lọc các ựặc tắnh mong muốn ở bố mẹ (haploid, 1x) sau ựó tạo cây dihaploid (2x), lai tạo các cây dihaploid (có các ựặc tắnh khác nhau) ựể tạo con lai 2x tổ hợp ựược các ựặc tắnh mong muốn của bố mẹ. Sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào ựể tổ hợp các ựặc tắnh mong muốn ở các dạng 2x. Kết quả thu ựược con lai soma 4x (tetraploid). Các dòng lai soma này ựược chọn lọc ựể phát triển thành giống có ựặc tắnh mong muốn.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 21
Hình 2.1. Sơ ựồ tạo giống khoai tây sử dụng tổng hợp kỹ thuật: Lai tạo, nuôi cấy bao phấn (nuôi cấy hạt phấn), nhị bội hóa và dung hợp tế bào
trần. (Wenzzel và cộng sự 1976) [63].
Theo ựịnh hướng này ựã có hàng loạt công trình của các tác giả nhằm giải quyết từng khâu của sơ ựồ tạo giống trên: các công trình về nghiên cứu kỹ thuật giảm ựộ bội của khoai tây tứ bội xuống nhị bội khi lai khoai tứ bội với dòng dại Solanum phureja (Nitzche và Wenzel, 1977); các công trình nghiên cứu về hoàn thiện kỹ thuật tách protoplast và dung hợp protoplast khoai tây theo các phương pháp hoá học, ựiện học (Thomas 1981, Bokelmann, Roest 1983. Eduard Chani và cộng sự (2000) ựã áp dụng công nghệ dung hợp protoplast và nuôi cấy bao phấn ựể tạo các cây ựơn bộị Các con lai soma ựược tạo ra từ tổ hợp lai giữa Solanum phureja Juz.&Buk. và S.
chacoense Bitt. Nuôi cấy hạt phấn của các con lai này ựể tạo 1 họ cây ựơn
bộị Có nhiều yếu tố ảnh hưởng ựến nuôi cấy bao phấn như ựiều kiện trồng cây cho bao phấn; phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy; ựiều kiện nuôi
a*
1a2a3a4 a1a*
2a3a4 a1a2 a*
3a4 a1a2a3 a* 4
Tạo dòng nhị bội nhờ kỹ thuật parthenogen etic
a*1a a*2a a*3a a*4a
Chọn lọc (2x)
Tạo dòng ựơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn Ờ nhị bội hóa tạo 2x
a* 1a* 1 a* 2a* 2 a* 3a* 3 a* 4a* 4 Chọn lọc (2x) x x a*1a*2 (+) a*3a*4 a*1 *2a*3a*4
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 22
cấy; kiểu gen; thời gian lấy bao phấn... đa số các cây tái sinh ựều là cây nhị bội, ựiều này chứng tỏ rằng có một số alen ựã bị ựào thải trong thể dị hợp ở cây cho hạt phấn. Trong các cây tái sinh, các thể ựồng hợp cũng ựược xác ựịnh thành công bằng chỉ thị phân tử SSR với 8 cặp mồị
Trong giai ựoạn những năm 80 ựến 90, các nghiên cứu nhằm phát triển các phương pháp tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh các thể lai soma ựược tiến hành rất mạnh mẽ (haberlach và cs,1985; Austin và cs, 1985a; Fish và cs, 1988; Perl và cs , 1988; Schilde, Rentschler và cs, 1988; Deimling và cs,1998; Masson và cs, 1988; Hunt và Helgeson, 1989; Chaput và cs, 1990; Wenzel, 1992; Thach et al., 1993). Các công trình nghiên cứu tạo các con lai soma tổ hợp ựược các ựặc tắnh kháng bệnh virus từ bố mẹ ựã chọn lọc (2x) cũng ựược rất nhiều tác giả nghiên cứu thành công. Các tác giả này thừa nhận có thể tổ hợp ựược các ựặc tắnh kháng bệnh (virus PVY, PVX, mốc sương, rệp) của bố mẹ vào con lai soma và các ựặc tắnh này có thể quan sát rõ trên ựồng ruộng. Tuy nhiên những dòng con lai soma có nhiều biến dị trên ựồng ruộng cần phải chọn lọc. [31], [12], [29], [27], [25], [54].
Thạch và cộng sự (1993) ựã chọn lọc thành công 14 dòng khoai tây nhị
bội S. tuberosum mang gen kháng Rx hoặc Ry hoặc cả hai, biểu hiện tắnh
kháng rất cao với virus PVX, PVY, ựiều này rất ý nghĩa ựể tiến hành nghiên cứu dung hợp tế bào trần giữa chúng nhằm tạo thể lai soma mang ựặc tắnh kháng bệnh virus. Các tổ hợp chọn cho dung hợp hầu hết tạo thể lai tứ bội (tetraploid), một số kết quả khác gần 50% là thể lục bội (hexaploid) và thể bội không hoàn chỉnh (aneuploid). đặc biệt một tổ hợp lai thu ựược có tới 94% dòng lai soma, trong khi ựó những tổ hợp khác chỉ có 2% là dòng lai somạ đa số các con lai soma thu ựược có biểu hiện tắnh kháng virus của cả hai ựối tượng khoai tây dung hợp, con lai ựược xác ựịnh bằng kỹ thuật RFLP và phân tắch isozyme với 2 loại enzym esterase và peroxidasẹ
Lu Wenhe và cộng sự (2004) cho rằng dung hợp tế bào trần không chỉ vượt qua rào cản lai tạo thông thường mà còn thu ựược các thể lai soma, do
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 23
vậy con lai soma sẽ thể hiện ưu thế lai rất rõ. Kỹ thuật dung hợp tế bào ựã ựược nghiên cứu và ứng dụng thành công trong việc phát triển các giống cây trồng mớị Có thể kể tên một số giống ựã thương mại hoá thành công như : cam "Oretachi" (cam + cam ba lá), "Shuvel" (quắt Satsuma + cam), "Gravel" (cam lai bưởi chùm), "Murrel" (murcott +cam) và "Yuvel" (Yuzu + cam), Giống thuốc lá bất dục ựực Ms-F 224. Ngoài ra nhiều dòng bất dục ựực dùng ựể sản xuất hạt F1 ở lúa, cà rốt, cải bắp và cà cũng ựược phát triển bằng kỹ thuật dung hợp tế bàọ
Với sự phát triển không ngừng của các công nghệ hiện ựại kết hợp với các kỹ thuật truyền thống, các gen kháng hai loại virus PVY và PVX ựã ựược xác ựịnh thông qua các nghiên cứu di truyền và chỉ thị phân tử (Blackburn & Barker, 2001). Các trình tự liên quan ựến khả năng kháng virus ở khoai tây ựã ựược xác ựịnh. Bên cạnh ựó, hơn 5881 SSRs ở khoai tây ựã ựược tìm thấỵ đây chắnh là những cơ sở dữ liệu quan trọng ựể ứng dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện ựại (tin sinh học, chỉ thị phân tử) nhằm nhanh chóng tạo các giống khoai tây theo ựịnh hướng mong muốn. D.Milbourne và cộng sự (1998) ựã thành công trong việc phân lập, ựánh giá và lập bản ựồ SSR cho khoai tâỵ Các nhà nghiên cứu ựã thiết kế và tổng hợp thành công 120 cặp mồi với vị trắ chắnh xác trên ADN của khoai tây ựược thiết kế và tổng hợp. đây là những giữ liệu rất quan trọng cho nghiên cứu di truyền ở khoai tây trong tương laị Kế thừa những kết quả này, Ye ỜSo Song và cộng sự (2005) ựã xây dựng thành công bản ựồ gen Rysto (gen kháng cực kỳ cao với virus PVY), gen này nằm trên nhiễm sắc thể số XII của khoai tâỵ 12 marker của gen Rysto ựã ựược sử dụng ựể phân tắch ựa hình của 106 giống khoai tây của đức, Ba lan, Thụy sỹ. Locus của gen Rysto ựã ựược xác ựịnh nằm trên nhiễm sắc thể số XII bằng mồi STM0003. Sử dụng các dòng khoai tây nhị bội tạo ra từ nuôi cấy hạt phấn sơ cấp ựể phát triển các chỉ thị phân tử ựã ựược chứng minh. đây là nguồn marker tiềm năng cho chương trình chọn tạo giống khoai tây có các ựặc tắnh mong muốn. [49], [64].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 24
Gần ựây, có nhiều hướng nghiên cứu mới là sử dụng nguồn gen khoai tây dại có ựặc tắnh kháng bệnh và dịch hại (virus, Phytophtora infestan, rệp truyền bệnh... ) rất ựiển hình làm nguyên liệu dung hợp trực tiếp với các dòng khoai tây trồng ựể tạo các con lai soma mang ựặc tắnh chống chịu virus mốc sương và rệp truyền bệnh Các dòng lai này sẽ ựược sử dụng làm vật liệu lai lại (BC) với chắnh bố mẹ của chúng. Kết quả tạo ra các dòng khoai tây trồng trọt mang ựặc tắnh kháng bệnh virus rõ rệt cùng với các ựặc tắnh nông sinh học tốt của bố mẹ. đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại ựể chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào trần và lai hữu tắnh: S. chacoense (Butenko và cs, 1982); S.niggrum (Binding và cs, 1982; 1988); S.brevidens (Austin và cs, 1985; helgeson, 1993);
S.circaeifolium (Mattheij và cs, 1992); S.berthaultii (Serraf và cs,1991);
S.commersonii (Cardi và cs, 1993); S. khasianum, S.aculeatissimum
(Stattmann và cs, 1994); S.pinnatisectum (Schilde-Rentschler và cs, 1993; Thieme và cs, 1995); S.bulbocastanum (Austin và cs, 1993; Brown và cs, 1995; Schilde-Rentschler và cs, 1993; Thieme và cs, 1995, 2004, 2008, 2010). [12], [32], [39], [48], [21], [57], [58], [59].
2.5.2. Một số nghiên cứu về dung hợp tế bào trần trên ựối tượng cây khoai tây ở Việt Nam
Mặc dù thế giới ựang tiến rất nhanh và ựạt ựược khá nhiều thành tựu trong chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh và sâu hại bằng công nghệ dung hợp tế bào trần, song ở Việt Nam, cho ựến nay công nghệ này vẫn còn hết sức mới mẻ. Tuy vậy các nghiên ở Việt Nam cũng ựã ựạt những kết quả bước ựầu quan trọng ựó là tìm ra quy trình tách và dung hợp tế bào trần. (Nguyễn Thị Phương Thảo, 2012). [10]
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 25