3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1.Các phương pháp nghiên cứu trong phòng
3.3.1.1. Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành:
Các dòng khoai tây nhị bội (diploid) ựược nuôi cấy in vitro trong môi trường MS. Cây in vitro ựược ựặt trong phòng nuôi theo chế ựộ nhiệt ựộ là 210C, cường ựộ chiếu sáng 3000 Ờ 4000 lux, quang chu kỳ 16h chiếu sáng/ngàỵ
3.3.1.2. Phương pháp xác ựịnh con lai bằng ựếm ựộ bội flow cytometry .
Nguyên lý: đây là một công nghệ dùng ựể ựếm và xác ựịnh những hạt siêu nhỏ như tế bào và nhiễm sắc thể. Bằng cách làm nổi chúng trong một dòng chảy và dẫn qua bộ từ trường. đây là một phép ựo các thông số quang học (huỳnh quang) của các dạng hạt siêu nhỏ trong dịch huyền phù (tế bào, nucleicacid), vận chuyển trên một dòng chảy ựơn qua các ựiểm ựo lường. Mỗi hạt huyền phù có kắch thước từ 0,2 Ờ 150 ộm chạy qua một tia sáng, khi ựó các chất huỳnh quang sẽ tìm thấy các hạt này hoặc lực hút các thể này sẽ ựược tắnh toán. Khi các hạt này chạy qua nguồn sáng UV, chất màu ựược nhuộm huỳnh quang sẽ tương ứng với hàm lượng ADN. Dấu hiệu của chất nhuộm huỳnh quang ựược biến ựổi tùy thuộc vào tắn hiệu electron. Các giá trị ựo ựược sẽ ựược tắnh toán và tóm tắt trên một biểu ựồ. Số lượng nhân tất nhiên sẽ tương ứng với hàm lượng ADN.
Quy trình ựánh giá mức ựa bội của tế bào thực vật (phụ lục 4)
3.3.1.3. Phương pháp xác ựịnh con lai bằng chỉ thị ISOZYME (theo Thach và cs, 1993)
Từ kết quả ựánh giá ựộ bội thông qua máy Flow cytometry chúng ta sẽ lọc ựược những dòng tứ bộị Tuy nhiên không phải tất cả các dòng tứ bội ựó ựều là con lai dị nhân (heterozygous) do vậy ựể tìm ra ựâu là con lai dị nhân cần tiến hành theo nhiều phương pháp khác nhaụ Nghiên cứu ựã sử dụng 2 loại isozym là esteraza và peroxidaza cho xác ựịnh con lai somạ Phương pháp và hóa chất ựược thể hiện trong phụ lục 3.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
3.3.1.4. Phương pháp xác ựịnh con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR: dựa
trên chỉ thị phân tử SSRkết hợp sử dụng hệ thống phân tắch di truyền ựa năng GenomeLab GeXP 8800 (Beckman GenomeLab Coulters)
Phương pháp chiết tách ADN
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số của GS. Hans Ờ Joerg Jacobsen trường đại học Hannover (Phụ lục 5).
Sau khi tách chiết DNA xong tiến hành kiểm tra ựộ nguyên vẹn của DNA tổng số bằng ựiện di trên gel agarose 1%. Nếu ựạt yêu cầu thì thực hiện thắ nghiệm chạy phản ứng PCR với cặp mồi ựặc hiệụ
Phương pháp sử dụng mồi SSR:
- Các mồi SSR sử dụng ựược trình bày ở bảng như trong phần vật liệu - Các mồi ựánh dấu và không ựánh dấu do Biomers net GmbH (đức) cung cấp. Phản ứng ựánh dấu các ựoạn ADN với chất nhuộm huỳnh quang sử dụng ba mồi: một mồi xuôi với ựuôi M13 ở ựầu 5Ỗ, một mồi ngược và một mồi M13 chung (Schuelke, 2000).
- Sử dụng máy MJ Research Thermocycler (PTC-200) ựể tăng cường nồng ựộ của các ựoạn chỉ thị.
- Thể tắch của dung dịch phản ứng PCR là 20 ul, bao gồm 25 ng DNA, 1x dung dịch ựệm PCR, 2.5 mM MgCl2, 200 uM cho mỗi dNTP, 0.1 uM mồi xuôi có ựánh dấu ựuôi, 0.17 uM mồi ngược, 0.07 uM mồi ựánh dấu M13 và 0.5 ựơn vị enzyme Taq DNA polymerasẹ
- Chu kỳ PCR bao gồm: bước ựầu tiên 5 phút; 30 chu kỳ với mỗi chu kỳ kéo dài 30 giây ở 94oC, 45 giây ở 60oC, 45 giây ở 72oC; 8 chu kỳ với 30 giây ở 94oC, 45 giây ở 56oC, 45 giây ở 72oC; và bước kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 10 phút.
- Sản phẩm PCR ựược cho vào ống mao quản và phân tắch theo thiết bị GenomeLab GeXP 8800 (Beckman Coulter). Kắch thước của các ựoạn ADN ựược xác ựịnh tự ựộng bởi phần mềm phân tắch chuyên dụng ựi kèm với máy
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
3.3.1.5. Phương pháp ựánh giá khả năng kháng virus bằng phương pháp DAS Ờ ELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme Ờ linked imunosorbent assay) Bước 1: Cố ựịnh kháng thể IgG ựặc hiệu của virus vào bản ELISA
IgG hòa trong dung dịch ựệm carbonat, cho vào mỗi giếng 200ộl. đặt bản ELISA trong hộp ẩm có nắp ựậy, ựể vào tủ ấm ở nhiệt ựộ 370C trong 2 giờ. Sau khi ủ, các giếng ựược rửa bằng dung dịch ựệm rửa (PBS-T) 4 lần.
Bước 2: Cố ựịnh dịch cây vào bản ELISA
Nghiền mỗi mẫu 1g trong ựệm chiết với ựộ pha loãng 1/10. Dịch cây ựược nhỏ vào bản ELISA với lượng 200ộl/1giếng. đồng thời cho 200ộl dung dịch ựối chứng âm và 200ộl dung dịch ựối chứng dương vào các giếng ựánh dấu riêng. Ủ bản Elisa ở 370C trong 2 giờ. Sau khi ủ các giếng ựược rửa bằng dung dịch ựệm rửa (PBS-T) 4 lần, mỗi lần trong 5 phút.
Bước 3: Cố ựịnh IgG liên kết Enzyme
Hòa IgG liên kết enzyme (IgG Ờ E) trong dung dịch ựệm liên kết. Cho vào mỗi giếng 200ộl. Bản ELISA ựược ủ trong 2 giờ và rửa như bước 2.
Bước 4: Cố ựịnh chất nền vào bản ELISA
Hòa chất nền NPP (nitrophenol phosphate) vào dung dịch ựệm subtra theo tỷ lệ ựã chọ Sau ựó nhỏ vào mỗi giếng 200ộl. Bản ELISA ựể trong hộp ẩm ựược ựặt ở nhiệt ựộ phòng. Quan sát sự phản ứng màu ở các giếng. Sau 1 giờ các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng dương tắnh, giếng không có màu là không có phản ứng. Kết quả ựược ựọc chắnh xác hơn trên máy ựọc ELISA ở bước sóng 405nm.
3.3.1.6. Phương pháp phân tắch các chỉ tiêu chất lượng * định lượng ựường khử (phương pháp iod-Ixekutz)
Nguyên liệu: Dịch chiết ựược chuẩn bị theo phương pháp Bertrand (phụ lục 7).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
Cho vào bình 1: 5ml nước cất, bình 2: từ 2 Ờ 5ml dịch chiết ựường, cho vào mỗi bình 10ml K3Fe(CN)6 0.05N. đun sôi 1 phút trên bếp ựiện, ựể nguộị Cho vào mỗi bình 10ml hỗn hợp (ZnSO4+ KI), 10ml CH3COOH 10%.
Chuẩn ựộ bằng Na2S2O3 0.05N cho ựến màu vàng rơm. Thêm 3 giọt tinh bột (dung dịch chuyển màu xanh), chuẩn ựộ tiếp cho tới khi có màu trắng sữa hoàn toàn.
* định lượng ựường tổng số
để xác ựịnh toàn bộ ựường trong mẫu, chúng ta phải tiến hành thủy phân ựể chuyển dạng ựường không khử thành dạng ựường khử (chủ yếu là disaccarit thành monosaccarit) sau ựó tiến hành xác ựịnh ựường khử thủy phân theo phương pháp ựịnh lượng ựường khử (Ixekutz).
Nguyên liệu: Dịch chiết ựược chuẩn bị theo phương pháp Bertrand (phụ lục 7).
Tiến hành: Lấy 10ml dịch chiết ựường thêm vào 2ml HCl 6N. đặt trên bếp cách thủy nhiệt ựộ 700-800C trong thời gian 20 phút. Thỉnh thoảng lắc ựều các ựường kép ựã ựược thủy phân thành ựường ựơn. Sau khi ựể nguội, cho vào bình 3 giọt phenolphtalein 1% trong cồn 96oC. Trung hòa lượng axit còn dư bằng dung dịch NaOH 10% cho ựến khi có mầu hồng. Làm chua lại bằng dung dịch CH3COOH 10% cho ựến khi mất màụ Dùng nước cất ựể lên thể tắch ựến vạch, ựược dịch chứa ựường khử. Sau ựó xác ựịnh ựường như phương pháp Ixekutz. (chú ý khi tắnh kết quả cần chú ý tới hệ số pha loãng).
* định lượng tinh bột (phương pháp thủy phân bằng axit)
Nguyên tắc: Dưới tác dụng của axit tinh bột ựược thủy phân hoàn toàn thành ựường glucosẹ định lượng ựường khử, suy ra hàm lượng tinh bột.
Nguyên liệu: 2g củ khoai tây
Tiến hành: Nghiền 2g nguyên liệu, nghiền nhỏ, trộn ựều chuyển sang cốc. Cho vào cốc 100ml nước cất, khuấy ựều từ 45-60 phút. Sau ựó lọc bằng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
phễu có giấy lọc. Tráng cốc và rửa tinh bột nhiều lần bằng nước cất ựể loại toàn bộ ựường khử khỏi tinh bột.
Chuyển phễu lọc chứa tinh bột sang bình 250ml, dùng ựũa thủy tinh nhỏ chọc thủng giấy lọc, chuyển tinh bột xuống bình cầu bằng nước cất (80- 100ml). Sau ựó cho 125ml HCl 25% vào bình. đặt bình vào nồi cách thủy sôi, ựun nóng từ 3-4h, thỉnh thoảng lắc ựềụ Sau khi kết thúc thủy phân tinh bột, làm nguội bình, trung hòa dịch thủy phân bằng NaOH 10%, dùng giấy quỳ thử sao cho dung dịch thủy phân không thừa kiềm. Sau ựó thêm 1-2 giọt HCl 25% ựể dung dịch thủy phân ựã ựược trung hòa có ựộ axit yếụ Chuyển toàn bộ dung dịch sang bình ựịnh mức 100ml, dùng nước cất ựịnh mức tới mức của bình. Khuấy ựều, lọc dung dịch, dung dịch lọc trong suốt, ựể ựịnh lượng ựường khử.
* định lượng vitamin C (phương pháp chuẩn ựộ bằng iot)
Nguyên lý: Vitamin C có thể khử dung dịch iot. Dựa vào lượng iot bị khử bởi vitamin C có trong mẫu suy ra hàm lượng vitamin C.
Nguyên liệu: 2g củ khoai tây
Tiến hành: cho 2g nguyên liệu vào cối sứ và một ắt HCl 2% tiếp tục nghiền, sau ựó chắt lấy nước trong, lặp lại tương tự 3-4 lần và kết thúc quá trình chiết rút. Dùng 10ml HCl 2% tráng cối và chày sứ có cả bã sang bình ựịnh mức (50ml) dùng nước cất lên thể tắch ựến vạch.
đặt bình ựịnh mức trong bóng tối khoảng 10 phút cho lượng axit ascorbic có trong nguyên liệu ựược hòa tan hoàn toàn, lọc lấy dịch trong. Lấy 10ml dịch lọc trong cho vào bình tam giác (100ml). Thêm vào ựó 10 giọt tinh bột 0.5%. Lắc nhẹ dùng I2 0.01N chuẩn ựộ cho tới khi dung dịch bắt ựầu xuất hiện màu xanh lam nhạt là ựược.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32