Hiện nay ở nước ta việc nghiên cứu về bacteriocin từ vi khuẩn lactic đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên các nghiên cứu ứng dụng của bacteriocin trong bảo quản thực phẩm, thủy sản còn ít và chưa thu được những kết quả khả quan.
Trong những năm 2004, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội đã khảo sát đa dạng sinh học, khả năng sinh bacteriocin và tính chất probiotic của hệ vi khuẩn lactic đường tiêu hóa động vật (Đề tài khoa học cơ bản 2004-2005, mã số: 62 05 04). Nhóm tác giả Đại học Quốc Gia Hà Nội đã nghiên cứu khả năng sinh bacteriocin của chủng
Lactobacillus plantarum L24 và nhận thấy vi khuẩn này vừa có khả năng sinh lactic acid vừa có khả năng sinh bacteriocin II [6]. Bacteriocin đã được tinh sạch bằng sắc ký lọc gel và điện di trên gel SDS-PAGE có trọng lượng phân tử vào khoảng 10-30 kDa.
Ngoài ra, một nghiên cứu khác cho thấy vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sản sinh bacteriocin có khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm như E. coli, Samonella và một số vi khuẩn lactic khác [3]. Nghiên cứu này còn cho thấy bacteriocin bắt đầu được sản sinh ở L.acidophilus từ giờ thứ 12, ở nhiệt độ 30÷370C với pH 5÷7 và vi khuẩn có thể sử dụng các loại đường như manitol, maltose, lactose
và glucose. Hoạt tính bacteriocin tăng khi bổ sung 1% cao nấm men. Bacteriocin nhạy cảm với protease nhưng lại bền với các dung môi hữu cơ, sự thay đổi pH và xử lý nhiệt.
Trong việc nghiên cứu quy trình muối chua cây nha đam, các thí nghiệm tiến hành dựa trên 2 phương pháp: lên men có bổ sung giống Lactobacillus plantarum và lên men không bổ sung giống. Kết quả cho thấy muối chua có bổ sung giống cho thành phẩm có chất lượng tốt hơn và đồng đều hơn [4].
Nhóm nghiên cứu ở Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã thu nhận bacteriocin bằng phương pháp len men bởi tế bào Lactococcus lactic cố định trên chất mang Cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu [8]. Kết quả cho thấy hiệu quả sử dụng chế phẩm tế bào vi khuẩn cố định trên BC để lên men thu nhận bacteriocin khá cao, có thể tái sử dụng 9÷10 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men, số lượng và khối lượng bacteriocin so với đối chứng. Khi sử dụng màng mỏng BC hấp phụ dịch bacteriocin 200 AU/ml để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu cho thấy thời gian bảo quản thịt tươi đến 3 ngày mà vẫn đảm bảo chất lượng theo TCVN 7046:2002.
Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào các sản phẩm thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảm quan có nhiều ưu việt hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên. Có được ưu điểm này là do ngoài những tính chất ưu việt vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin, một chất bảo quản thực phẩm. Tuy nhiên những nghiên cứu trực tiếp về vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản thủy sản thực phẩm còn hạn chế.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nước dưa: Mẫu để phân lập vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được lấy từ nguồn nước dưa chua được mua tại các chợ ở Nha Trang, Khánh Hòa vào tháng nguồn nước dưa chua được mua tại các chợ ở Nha Trang, Khánh Hòa vào tháng 3÷5/2010.
Hình 2.1 Ảnh nước dưa chua
2.1.2 Chủng vi khuẩn chỉ thị
Các chủng Salmonella, Bacillus, Vibrio, E. coli được lấy từ bộ sưu tập vi sinh vật của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang. Các chủng E. coli GA, S. aureus và C. perfringens được lấy từ bộ sưu tập vi sinh vật của Phân viện thú y Miền Trung tại Nha Trang.
Chủng Salmonella Sal1 được nuôi cấy trên môi trường RV, pH 5,2÷5,7, nuôi trong tủ ấm ở 370C trong 15÷20 giờ.
Các chủng Bacillus (B1.1, B2.3) được nuôi cấy trên môi trường TSB, pH 7,3 ± 0,2, lắc 180 vòng/phút trong 15÷20 giờ.
Các chủng Vibrio (C1, CR6, CR7, V3.3) được nuôi cấy tương tự như chủng
Bacillus B1.1 nhưng đem lắc 150 vòng/ phút.
Các chủng E. coli (H10b, L2.1, TN3, TN4.1, TN4.2, TN5.2) được nuôi cấy trên môi trường TSB, pH 7,3 ± 0,2.
Các chủng S. aureus, C. perfringens được nuôi cấy trên môi trường TSB, ủ ở 370C trong vòng 15÷20 giờ.
2.1.3 Cá giò
Hình 2.2 Ảnh cá giò nguyên liệu tươi
Cá giò (Rachycenton canadum) nguyên liệu tươi được thu mua tại các lồng nuôi cá giò ở Lương Sơn, Nha Trang, Khánh Hòa.
Loài: Cá giò
Tên khoa học: Rachycentron canadum (Linnaeus, 1766)
Tên tiếng Anh: Cobia
Có khối lượng 2-2,5kg. Kích thước 0,5-0,6m.
2.1.4 Thiết bị chuyên dụng
- Máy ly tâm ( Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ) - Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)
- Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300, Mỹ)
- Máy định lượng protein bằng quang phổ hấp thụ phân tử (UV/VIS) (Carry 100 Bio, Úc)
- Máy lắc (GFL 3005, Đức)
- Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha) - Tủ sấy (Binder, Đức)
- Nồi khử trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan) - Lò vi sóng phá mẫu (LG, Hàn Quốc)
2.1.5 Hóa chất, môi trường
a) Môi trường tăng sinh APW (Alkaline Peptone Water)(Bảng 1, phụ lục 5)
b) Môi trường rắn nuôi cấy vi khuẩn tổng số TSA (Trypton soy agar) (Bảng2, phụ lục 5)
c) Dung dịch nước muối sinh lý
Hoà tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút.
d) Dung dịch xanh methylen
Xanh methylen là chất màu sử dụng để tạo màu cho môi trường được bổ sung thêm cho môi trường TSA. Cân 0,04 g xanh methylen /1l môi trường thạch TSA.
e) Môi trường phân lập MRS (Lactobaccillus MRS Broth) (Bảng 3, phụ lục 5)
Các vi khuẩn lactic được phân lập và nuôi cấy trên môi trường MRS có thành phần như sau (g/l):
f) Môi trường nuôi cấy TSB(Trypton Soy Broth) (Bảng 4, phụ lục 5)
g) Môi trường nuôi cấy RV (Rappaport Vasiliadis) (Bảng 5, phụ lục 5)
h) Môi trường nuôi cấy PCA (Plate Count Agar)
PCA là môi trường tổng hợp nên pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất: Pha 20,5 g trong 1000 ml nước cất, pH khoảng 7,0÷7,2. Sau khi pha xong môi trường hấp khử trùng 1210C trong vòng 15 phút [11].
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic
Mẫu nước dưa muối được pha loãng tới các nồng độ từ 10-1 đến 10-6 bằng dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, sau đó được cấy trang trên môi trường chọn lọc MRS [11] và nuôi ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Các chủng vi khuẩn lactic được bảo quản trong glycerol 30% ở -800C.
2.2.2 Xác định đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn lactic
Các chủng vi khuẩn lactic được quan sát dưới kính hiển vi quang học theo phương pháp nhuộm Gram như sau: Sử dụng tế bào vi khuẩn được nuôi trong 24h để làm tiêu bản. Làm vết bôi trên lam kính, để khô, cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm vết bôi bằng tím violet trong 30s÷1 phút rồi rửa lại nước, xử lý tiêu bản bằng thuốc nhuộm Lugol trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa lại bằng cồn 900C
Nhuộm tiếp tiêu bản với Fuchsin trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa lại với nước. Để tiêu bản khô, sau đó đưa lên vật kính dầu quan sát X -100.
2.2.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
Hoạt tính sinh bacteriocin từ các chủng vi khuẩn lactic phân lập được xác định bằng phương pháp khuếch tán quanh lỗ thạch (well diffusion assay). Sau 16-24h nuôi trên môi trường MRS ở 370C, dịch tế bào vi khuẩn lactic được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C để thu dịch nổi. Sau đó dịch nổi được điều chỉnh pH đến 7,0 bằng NaOH 1N.Các chủng chỉ thị được nuôi trong đĩa thạch mềm (0,75%) có bổ sung dịch nhuộm màu methylene blue 0,4% ở 370C trong 24 giờ. Thạch được đục lỗ với đường kính 10 mm, rồi nhỏ vào 200 µl dịch vi khuẩn lactic sau ly tâm ở trên và ủ ở nhiệt độ 370C trong 12-24h. Hoạt tính bacteriocin của mẫu thí nghiệm được xác định theo vòng kháng khuẩn (D-d, mm) trong đó D và d lần lượt là các đường kính của vòng ức chế và lỗ thạch [16]. Nếu tính theo đơn vị hoạt độ AU/ml, hoạt tính của bacteriocin (AU/ml) là nghịch đảo của nồng độ pha loãng cao nhất (D), tại đó bacteriocin vẫn thể hiện vòng kháng rõ ràng với chủng chỉ thị (D-d ≥ 6 mm). Công thức tính như sau: AU/ml = (1000/V)*D trong đó V (ml) là thể tích dịch nhỏ vào giếng trên đĩa thạch [20]. Để xác định bản chất của bacteriocin, dịch chiết tế bào vi khuẩn lactic được trộn với proteinase K (Promega) hoặc α-chymotrypsin (Promega) ở nồng độ cuối cùng đạt 1 mg/ml, ủ ở 50oC trong 3h, sau đó bất hoạt enzym tại 80oC trong 20 phút [25]. Sau khi xử lý enzym, các mẫu được trung hòa tới pH 7 và sau đó xác định hoạt tính còn lại của bacteriocin như mô tả ở trên.
2.2.4Xác định cơ chế kháng khuẩn của chủng phân lập
Nhằm tìm hiểu cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin, chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng dịch bacteriocin thô của chủng T13 đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus B1.1. Dịch chiết tế bào nuôi 12h tuổi của chủng T13 với các hoạt tính kháng khuẩn khác nhau lần lượt là 400AU/ml (lượng dịch cho vào 1/25ml so với tổng lượng dịch nuôi cấy), 400AU/ml (pH=7)(1/25ml), 800AU/ml (pH=7)(1/15ml), 1600 AU/ml (pH=7)(1/6ml) được bổ sung vào pha sinh trưởng log (sau 2h nuôi cấy) của chủng Bacillus B1.1 (lắc ở 200 vòng/phút). Sau đó mỗi 1h lấy dịch đo mật độ quang tại bước sóng 540 nm (OD540) trên máy đo quang phổ Cary 100 Bio (Varian, Mỹ).
2.2.5 Xác định mức độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic
Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic được xác định bằng phép đo mật độ quang của dịch nuôi tại bước sóng 600 nm (OD600). Tổng số vi khuẩn lactic được đếm theo phương pháp đổ đĩa trên môi trường MRS [11].
2.2.6 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của vi khuẩn lactic
a) Nguồn cacbon
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm với lượng đường cho vào là 20g, với các loại đường khác nhau: glucose; lactose; fructose; dextrin; saccarose. Thành phần khác trong môi trường cố định. Nhiệt độ nuôi cấy là 370C. pH môi trường nuôi cấy 6.5. Thời gian nuôi cấy thích hợp ở thí nghiệm trước. Sau đó tiến hành đo độ đục để xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic và chọn loại đường thích hợp nhất cho quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic.
b) Nguồn nitơ
Tiến hành 4 mẫu thí nghiệm với các nguồn nitơ khác nhau như: bột đậu nành; Pepton; urê; NH4Cl, lượng nitơ cho vào là 25g. pH môi trường nuôi cấy 6,5. Nhiệt độ nuôi cấy là 370C. Nguồn cacbon thích hợp nhất đã được xác định ở thí nghiệm trước. Thời gian nuôi cấy thích hợp ở thí nghiệm trước. Sau đó tiến hành đo độ đục để xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic để chọn nguồn nitơ thích hợp nhất cho quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic.
c) pH môi trường
Tiến hành 8 mẫu thí nghiệm có pH lần lượt là 5,6; 5,8; 6,0; 6,2; 6,4; 6,6; 6,8; 7,0. Nuôi cấy ở nhiệt độ là 370C. Thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp ở thí nghiệm trước. Sau đó tiến hành đo độ đục để xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic và chọn pH thích hợp nhất cho quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic.
d) Nhiệt độ nuôi cấy
Tiến hành với 8 mẫu thí nghiệm đem ủ với nhiệt độ (0C) lần lượt là 27; 29; 31; 33; 35; 37; 39; 41. Nuôi cấy ở pH, thành phần môi trường, thời gian thích hợp đã được xác định ở thí nghiệm trước. Sau đó tiến hành đo độ đục để xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic và chọn nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic.
2.2.7 Xác định phổ ức chế của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin
Để xác định khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin. Ta tiến hành thí nghiệm xác định phổ ức chế của chúng đối với các vi khuẩn đích như: Vibrio
(C1, CR7, CR6, V3.3), Bacillus (B1.1, B2.3), E. coli (H10b, L2.1, TN3, TN4.1, TN4.2, TN5.2, GA) , Salmonella Sal1, C. perfringens, S. aureus.
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định phổ ức chế của vi khuẩn lactic đối với một số vi khuẩn gây bệnh
2.2.8 Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu
Dựa vào mối quan hệ giữa khả năng sinh trưởng, hoạt tính dịch chiết của chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS chúng tôi tiến hành xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn đó trên da cá giò.
Để xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic trên cơ chất da cá giò nguyên liệu. Ta tiến hành thí nghiệm với 1 mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch cho vào túi PE và mẫu nhúng dịch để ngoài. Da cá được nhúng trong dịch 120 giây, ở nhiệt độ 300C [30]. Mẫu được lấy theo thời gian bảo quản: 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ để phân tích chỉ tiêu về tổng vi khuẩn lactic và tổng vi khuẩn hiếu khí. Để định lượng tổng vi khuẩn lactic chúng tôi dùng phương pháp đếm khuẩn lạc bằng cách đổ đĩa trên môi trường thạch MRS. Quy trình phân tích gồm chuẩn bị mẫu phân tích, cấy mẫu và tính kết quả theo Trần Linh Thước (2007) (Phụ lục 4).
Vibrio (C1, CR7, CR6, V3.3) Vi khuẩn lactic Bacillus (B1.1, B2.3) E. coli (H10b, L2.1, TN3, TN4.1, TN4.2, TN5.2, GA) Salmonella Sal1 Xác định hoạt tính của bacteriocin với từng vi khuẩn đích C. perfringens S. aureus
2.2.9 Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí
Để định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu da cá giò, chúng tôi dùng phương pháp đếm khuẩn lạc bằng cách đổ đĩa trên môi trường thạch PCA...Quy trình phân tích gồm chuẩn bị mẫu phân tích, cấy mẫu và tính kết quả theo Trần Linh Thước (2007) (Phụ lục 4).
2.2.10 Thí nghiệm kiểm tra khả năng kháng Salmonella, Vibrio của vi khuẩn lactic trong quá trình bảo quản lactic trong quá trình bảo quản
Vào ngày bảo quản thứ 3 các mẫu được nhúng vào dịch tế bào vi khuẩn
Salmonella, Vibrio (nuôi ở 370C, 15÷20 giờ) trong 1 phút, các mẫu được bảo quản tương tự như thí nghiệm bảo quản cá Giò được nêu ở trên. Sau các ngày tiến hành kiểm tra khả năng kháng Salmonella, Vibrio của vi khuẩn lactic. Tổng vi khuẩn
Salmonella và Vibrio được xác định theo Trần Linh Thước (2007).
2.2.11 Thí nghiệm bảo quản cá giò bằng vi khuẩn lactic
Để xác định thời gian bảo quản cũng như ảnh hưởng của vi khuẩn lactic đến chất lượng của cá giò ta tiến hành thí nghiệm như sau:
Tiến hành bảo quản vừa ngâm cá vào dịch vi khuẩn lactic vừa kết hợp bảo quản lạnh ở nhiệt độ 0÷40C. Ngâm cá vào dung dịch có chứa vi khuẩn lactic trong 120s với thời gian bảo quản lần lượt là 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày. Song song ta tiến hành bảo quản cá theo phương pháp chỉ ướp đá ở nhiệt độ 0÷40C để làm mẫu đối chứng. Sau các ngày tiến hành đánh giá chất lượng của cá giò và xác định thời gian bảo quản cá phù hợp.
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian bảo quản cá giò
2.2.12 Đánh giá chất lượng của cá [10]
- Xác định NH3 bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước theo TCVN 3706-90 [1]. - Kiểm tra màu sắc, trạng thái bằng phương pháp cảm quan cho điểm theo TCVN 3215-79. Phương pháp cảm quan cho điểm là phương pháp đánh giá chất lượng cảm quan nguyên liệu và cho điểm theo một thang điểm qui định sử dụng hệ số điểm 20 điểm, thang điểm 6 bậc (từ 0-5) và điểm tối đa cho mỗi chỉ tiêu là 5, thang điểm mỗi chỉ tiêu được dựa theo TCVN 52-77-90 đối với cá nguyên liệu và phương pháp đánh giá cho điểm (theo phụ lục 2, Bảng 5).
Xác định thời gian bảo quản Đánh giá chất lượng cá
giò Cá giò
Ngâm cá vào dịch chứa vi khuẩn lactic (mật độ ≥1010 CFU/g) kết hợp với bảo quản lạnh ở nhiệt độ 0÷40C
Thời gian bảo quản (ngày) Bảo quản chỉ ướp đá
ở nhiệt độ 0÷40C (làm mẫu đối chứng)
Bảng 2.1 Bảng chỉ tiêu cảm quan của cá giò [10] Chỉ tiêu Hệ số quan trọng Trạng thái 1,2 Màu 1,1 Mùi 1,0 Vị 0,7
Điểm cảm quan chung = 1,2 x điểm trạng thái+ 1,1 x điểm màu + 1,0 x điểm mùi + 0,7 x điểm vị
Điểm có trọng lượng= điểm chưa có trọng lượng x hệ số quan trọng.
Điểm cảm quan chung là tổng số điểm có trọng lượng lượng của các chỉ tiêu đánh giá.
Hội đồng đánh giá cảm quan gồm 5 thành viên có chuyên môn về chế biến thủy sản và thành thạo về cách đánh giá cảm quan.