- Kháng thuốc tự nhiên: Là tắnh kháng thuốc vốn có của một số vi khuẩn
3. đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.4. Xác ựịnh vi khuẩn gây bệnh viêm vú bò sữa bằng phương pháp phân lập vi khuẩn.
lập vi khuẩn.
Vi khuẩn gây viêm vú ựược phân lập theo phương pháp thường qui (Nguyễn Như Thanh và cs., 1997). Nuôi cấy các mẫu sữa cần chẩn ựốn vào
Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35 các môi trường thông thường và môi trường ựặc biệt ựể xác ựịnh các ựặc tắnh nuôi cấy, ựặc tắnh sinh vật hoá học của từng loại vi khuẩn.
Sơ ựồ phân lập Streptococcus và Staphylococcus (theo Carter G.R, 1995)
` Cặn sữa Cặn sữa Thạch máu (B.A) Gram Catalase (-), khuẩn lạc nhỏ, trong suốt Edward medium Streptococcus (khuẩn lạc tròn, nhỏ, trong, dạng S) Giám ựịnh
Kiểm tra ựặc tắnh nuôi cấy (Thạch thường, nước thịt,
thạc máu)
Kiểm tra ựặc tắnh sinh hóa
Catalase (+), khuẩn lạc to, ựục trắng hoặc vàng
có thể có
Staphylococcus medium (hoặc Sapman)
Staphylococcus (Mơi trường có màu vàng)
Giám ựịnh
Kiểm tra ựặc tắnh nuôi cấy (Thạch thường, nước thịt,
gelatin)
Kiểm tra ựặc tắnh sinh hóa
Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
Sơ ựồ phân lập E.coli (theo Carter G.R, 1995)
* Phương pháp giám ựịnh một số vi khuẩn:
Sau khi nhận biết khuẩn lạc của vi khuẩn trên thạch máu và các ựặc ựiểm hình thái của chúng, tiến hành kiểm tra các ựặc tắnh sinh hóa cơ bản, sử
Bị bình thường Mẫu sữa Bò viêm vú
Istrati
(Khuẩn lạc thuần khiến dạng S Ờ màu vàng)
đếm số khuẩn lạc E.M.B
Khuẩn lạc tắm ựen
Macconkey Khuẩn lạc ựỏ
Khuẩn lạc thuần khiết Endo
Khuẩn lạc ựỏ
Brillian green Khuẩn lạc vàng chanh
Tắnh chất sinh học Giữ trên thạch máu
Hình thái ni cấy đặc tắnh sinh hóa
Saccaroza Galactoza Glucoza Lactoza Kligler VP
H2S
Hình Di ựộng Gelatin Lismusmilk thái
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37 dụng một số biện pháp ựể phân biệt một số loài vi khuẩn gây bệnh chắnh.
- Phương pháp ựịnh danh Steptoccus gây viêm vú bò sữa:
Phương pháp CAMP: phản ứng CAMP ựược Chritstie, Atkins và Munch- Peterson (1994) phát minh và sử dụng ựể phân biệt các Steptococcus nhóm B (các Steptococcus gây bệnh viêm vú bò thuộc nhám B). Phản ứng dựa trên nguyên lý: Steptococcus nhóm B sản sinh một chất có thành phần giống Protein ựược gọi là CAMP factor, nó có thể cộng hoạt với tốc ựộ β Hemolysin của Staphylococcus aureus tạo ra một vịng dung huyết hồn tồn, hình mũi tên trên vùng dung huyết khơng hồn tồn (β) của Sta.aureus.
Ngày nay, phản ứng CAMP ựược cải tiến bằng cách cho thêm vào môi trường làm phản ứng 0,1% Esculinvà 0,01% Ferric Citrat ựể xác ựịnh các Steptococcus có khả năng phân giải Esculin và phản ứng ựược gọi là CAMP- Esculin test.
Tiến hành: Cấy một ựường thẳng Staphylococcus aureus chủng chuẩn ( dung huyết 2 vịng α và β) chia ựơi ựĩa thạch (0,1% Esculin và 0,01% Ferric Citrat). Sau ựó cấy các Streptococcus cần phân biệt theo hướng vng góc và cách ựường cấy Staphylococcus trên từ 2-3mm. Bồi dưỡng ở 37 0C/24h
Kết quả CAMP (+): Xuất hiện vùng dung huyết hồn tồn hình mũi tên nơi tiếp giáp giữa ựường cấy Steptoccocus với vùng dung huyết β của staphylococus aureus.
CAMP- Esculin test cho phép phân biệt các loại Streptococcus theo bảng sau:
Vi khuẩn CAMP Esculin Dung huyết
Strep. agalactiae + - α,β
Strep.dysgalactiae - - Α
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38 + Phương pháp ựịnh danh một số loại Staphylococcus.
Staphylococcus bao gồm các chủng gây bệnh của Straphylococcus aureus ựã ựược xác ựịnh là men Coagulase ựược sinh ra trong quá trình sống. Người ta có thể dựa vào sự có mặt của men này ựể phân biệt các Straphylococus gây bệnh với Staphylococcus khác. Phản ứng dùng ựể phân biệt này gọi là Coagulase test.
- Nguyên lý của phản ứng: Các chủng Straphylococcus aureus trong q trình sống có khả năng tiết ra một loại men Coagulase phân giải Fibrinogen thành Fibrin làm ựông huyết tương của một số ựộng vật.
-Phản ứng Coagulase trên phiến kắnh: Chuẩn bị ựĩa cấy vi khuẩn cần phân biệt, nước sinh lý trên một lam kắnh vô trùng, dùng que cấy lấy một vùng huyết tương thỏ Citrat hóa trộn ựều với hỗn hợp trên. Nếu phản ứng dương tắnh thì hiện tượng ựơng vón sẽ xuất hiện sau vài giây.