5. Phương pháp nghiên cứu
1.3. GIỚI THIỆU HỆ THỐNG NUƠI CẤY NGậP TẠM THỜI TIS
1.3.1. Giới thiệu
Ngày nay, việc nghiên cứu cải thiện các quy trình nhân giống thực vật nhất là cây hoa cảnh trong ống nghiệm rất được quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên khắp thế giới. Để khắc phục nhược điểm của hệ thống vi nhân giống thơng thường trên mơi trường thạch là cĩ tỷ lệ nhiễm cao, mơi trường nuơi cấy bão hồ hơi nước nên làm cho cây bị các hiện tượng trương nước, bị thủy tinh thể dẫn đến nhanh chĩng bị mất nước khi đưa ra ngồi điều kiện cĩ độ ẩm thấp hơn ở ngồi vườn ươm làm cho cây khơ và chết rất nhanh. Ngồi ra trên mơi trường thạch thường hạn chế hệ số nhân
SVTH: Đào Thị Lý -51-
chồi của cây. Cùng với tỷ lệ nhiễm cao, tỷ lệ sống sĩt thấp ngồi vườn ươm, chi phí cho mơi trường thạch, nhân cơng cao đã làm cho giá thành sản xuất lên cao.
Để khắc phục hệ số nhân thấp của cây trên mơi trường thạch, nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp nuơi cấy trong mơi trường lỏng cĩ hay khơng cĩ lắc. Kỹ thuật này cho phép đạt được hệ số nhân chồi, tạo phơi soma, PLB, và nhiều hơn so với trên mơi trường thạch. Tuy nhiên khi nuơi cấy trong mơi trường lỏng mẫu cấy bị trương nước và bị hiện tượng thủy tinh thể do ngập quá lâu trong mơi trường, ngồi ra mẫu cịn bị những tổn thương do quá trình lắc.
Vì vậy để kết hợp những ưu điểm của hệ thống nuơi cấy trên thạch với nuơi cấy lỏng, vào năm 1983, Harris và Mason đã thiết kế hai hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời là hệ thống nuơi cấy nghiêng và hệ thống Rocker.
Ít lâu sau, vào năm 1985 Tisserat và Vandercook đã thiết kế một hệ thống nuơi cấy tự động APCS đây là hệ thống cĩ thể thay thế được mơi trường và cĩ thể sử dụng nuơi cấy trong một thời gian dài mà khơng cần cấy chuyền. Ngồi ra cịn cĩ một số hệ thống ngập tạm thời một phần hay tồn phần được điều khiển tự động bằng máy tính hay bán tự động.
Hiện nay đáng chú ý là hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời RITA® của hãng Cirad, Pháp; BIT® Twin Flask của Cuba đã được khảo sát và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau. Một hệ thống cũng xuất hiện gần đây là hệ thống Plantima® của cơng ty Atech, Đài Loan. Hệ thống này cũng đã được tiến hành khảo sát trên nhiều đối tượng như chuối, hoa lan …
Những ưu điểm của những hệ thống ngập tạm thời cĩ thể liệt kê ngắn gọn như tạo ra mơi trường nuơi cấy thống khí, cây con khỏe mạnh, tỷ lệ sống sĩt cao, giảm tỷ lệ nhiễm, giảm chi phí nhân cơng, tiết kiệm và giảm chi phí mơi trường nuơi cấy do sử dụng ít mơi trường trên một mẫu cấy và khơng sử dụng agar.
1.3.2. Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống
Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi Teisson và cộng sự năm 1999: (1) tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy; (2) cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ; (3) cung cấp sự hịa trộn đầy đủ; (4) cĩ thể thay đổi mơi trường và điều khiển tự động; (5) hạn chế sự nhiễm; (6) giá thành hạ.
SVTH: Đào Thị Lý -52-
Tất cả các hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời đều phải tuân theo một nguyên tắc là phải cĩ khả năng tạo ra sự ngập khơng liên tục theo chu kỳ xác định. Các hệ thống đều cĩ ngăn chứa mơi trường riêng, cĩ thể chung một bình chứa nhưng cĩ hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển. Các mẫu cấy thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa polypropylene thành một cụm, điều này giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuơi cấy thơng thường.
Tĩm lại, hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời thơng thường cĩ những bộ phận chủ yếu sau:
- Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để hút mơi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại.
- Hệ thống cài đặt thời gian dùng để điều khiển chu kỳ ngập. - Hệ thống ống dẫn và van điều khiển.
- Các màng lọc thống khí.
- Bình nuơi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh. 1.3.3. Phân loại hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời.
Hệ thống ngập sử dụng trong vi nhân giống thực vật được mơ tả và phân loại theo 4 nhĩm chính theo cách thức vận hành như sau: hệ thống nuơi cấy ngập nghiêng lắc, hệ thống ngập hồn tồn cĩ sự thay mới mơi trường dinh dưỡng, hệ thống ngập một phần cĩ sự thay mới mơi trường dinh dưỡng, hệ thống ngập hồn tồn trong đĩ mơi trường dinh dưỡng được bơm nhu động vào khu vực nuơi cấy và khơng cĩ sự thay mới mơi trường.
Các hệ thống ngập được phân loại dựa trên các yếu tố về kích thước bình nuơi cấy, loại giá đỡ, cĩ hay khơng cĩ sử dụng hệ thống máy vi tính để điều khiển hay chỉ đơn giản điều khiển bằng các máy hẹn giờ (timers), cách thức vận chuyển mơi trường (sử dụng bơm nhu động, bơm khí hay di chuyển bình chứa).
Những điểm khác biệt khác giữa các hệ thống ngập là cĩ hay khơng cĩ việc tái sử dụng mơi trường dinh dưỡng, sử dụng hai bình chứa riêng biệt để dự trữ mơi trường và tăng sinh mẫu cấy hay chỉ sử dụng một bình.
Đặc điểm chung của các hệ thống này là sử dụng những bình chứa cĩ dung tích lớn hơn những bình chứa truyền thống, trong suốt và cĩ thể hấp khử trùng được.
SVTH: Đào Thị Lý -53-
Việc vận hành hệ thống này đơn giản hơn các bioreactor truyền thống và cho phép kéo dài thời gian cấy chuyền.
Những hệ thống nuơi cấy ngập cho phép lập trình chế độ ngập của mẫu cấy (ngập một phần hay ngập tồn phần). Các hệ thống ngập được chia làm 4 kiểu thiết kế như sau:
a. Hệ thống thùng nghiêng
Cĩ 2 hệ thống thuộc dạng này đã được miêu tả bởi Harris và Mason (1983): (1) hệ thống thùng nghiêng (máy nghiêng sẽ kéo bình tam giác nghiêng một gĩc 30o theo hai hướng ngược nhau, một máy cĩ thể kéo nghiêng khoảng 400 bình erlen dung tích 50 hoặc 320 bình tam giác dung tích 125 ml); (2) máy lắc Rocker (xoay 70 bình 910 ml cổ rộng hoặc nghiêng 120 chai 455 ml chai cổ rộng nghiêng sang hai phía 30 – 40o trong vịng 30 phút). Tuy nhiên, các hệ thống này khơng hỗ trợ việc thay mới mơi trường.
b. Hệ thống ngập hồn tồn với cơ chế thay mới mơi trường dinh dưỡng Tisserat và Vandercook (1985) phát triển một hệ thống với cơ cấu nâng buồng nuơi cấy. Mơi trường được bơm và rút khỏi buồng nuơi cấy theo chu kỳ nhất định trong điều kiện vơ trùng. Hệ thống nuơi cấy thực vật tự động gồm một ống silicone, 2 máy bơm cánh quạt, 2 bình chứa mơi trường dự trữ, van 3 chiều bằng thép khơng rỉ, một buồng nuơi cấy và một bảng điều khiển cĩ gắn các rờ-le điện. Hệ thống này
cho phép nuơi cấy thực vật in vitro trong thời gian dài.
c. Hệ thống ngập một phần cĩ cơ chế thay mới mơi trường dinh dưỡng Trong hệ thống này, mơ thực vật luơn nằm trên một giá đỡ (mơi trường agar, lưới propylene, nút cellulose). Chỉ cĩ phần dưới của mẫu tiếp xúc với mơi trường. Hệ thống này được phát triển thành 2 mơ hình:
Mơ hình (1): Aitken-Christie và Jones (1987), Aitken-Christie và Davies (1988) đã phát triển một quy trình bán tự động sử dụng một bình chứa bằng vật liệu
polycaronat, kích thước 250 x 390 x 120 mm. Trong hệ thống này, chồi cây Pinus
SVTH: Đào Thị Lý -54-
mẫu theo chu kỳ bằng một bơm nhu động. Mơi trường lỏng vừa được bổ sung sẽ tiếp xúc với mẫu cấy trong khoảng thời gian từ 4 đến 6 giờ, sau đĩ mơi trường được rút cạn. Mơ hình này hoạt động trên cơ sở ảnh hưởng tích cực của việc bổ sung mơi
trường lỏng hoặc auxin vào mơi trường bán rắn ở giai đoạn cuối của nuơi cấy in vitro
mà Maene và Debergh (1985) đã chỉ ra trước đĩ.
Mơ hình (2): hệ thống của Simonton và cộng sự (1991) gồm một máy bơm điều khiển bằng hệ thống vi tính cĩ thể bơm mơi trường lỏng vào bình nuơi cấy dung tích 7 lít một cách gián đoạn. Mẫu cấy nằm trên tấm lưới polypropylene được gắn vào thành bình. Quá trình điều khiển thực hiện ở việc nạp mơi trường, độ sâu mực chất lỏng, chu kỳ tuần hồn mơi trường lỏng, và được điều chỉnh theo lịch trình trong suốt quá trình nuơi cấy. Hệ thống cĩ khả năng điều khiển đồng thời 4 bình nuơi cấy.
d. Hệ thống ngập hồn tồn cĩ sự vận chuyển mơi trường lỏng bằng áp lực khí và khơng cĩ sự thay mới mơi trường.
Nhiều hệ thống khác nhau đã được Alvard và cộng sự (1993) miêu tả, trong đĩ cĩ những hệ thống nuơi cấy ngập được thiết kế gần đây nhất, tất cả đều khá đơn giản và dễ sử dụng. Hệ thống này cho phép tồn bộ mẫu tiếp xúc với mơi trường dinh dưỡng, kết hợp với sự làm mới bầu khơng khí trong bình nuơi cấy nhờ sử dụng bộ phận bơm khí cĩ nhiệm vụ vừa cung cấp khơng khí vào mơi trường, vừa cĩ tác dụng đẩy chất lỏng ra vào bình nuơi cấy. Mẫu cấy nằm trong hệ thống thành khối lớn nên khơng cần sử dụng giá đỡ.
Việc vận chuyển mơi trường lỏng từ bình dự trữ mơi trường sang bình nuơi cấy và ngược lại được thực hiện nhờ áp lực khí bơm vào bình chất lỏng. Để khơng phải sử dụng nhiều ống nối, hai bình chứa nên cĩ cùng thể tích. Áp lực tạo ra với sự hổ trợ từ các van solenoid hoặc máy nén nối với khĩa đã được lập trình để quy định thời gian và số lần ngập.
Do hệ thống khơng bao gồm bình chứa mơi trường mới nên cần thay mới mơi trường sau 4 – 6 tuần. Tuy nhiên, việc thay mới mơi trường này cĩ thể thực hiện dễ dàng nhanh chĩng mà khơng cần phải di chuyển mẫu cấy. Hai hệ thống khác nhau thuộc nhĩm này đã được phát triển thành sản phẩm thương mại và đưa ra thị trường là RITA® và BIT®.
SVTH: Đào Thị Lý -55-
Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập tạm thời, nhiều nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập khác nhau, tùy vào mục đích nuơi cấy khác nhau.
Sau đây là ba biến thể khác nhau đã được phát triển và bán rộng rãi trên thị trường, đĩ là hệ thống RITA®, thứ hai là hệ thống bình đơi BIT®, và hệ thống Plantima®.
1.3.4.1. Hệ thống RITA®
Hệ thống RITA® (xem hình 1.2) là cơng trình của Teisson và Alvard vào năm 1995. Một bình 1 lít chứa gồm cĩ hai phần, phần trên chứa mẫu cấy và phần dưới chứa mơi trường. Một áp suất vượt mức tác động vào mơi trường lỏng chứa trong phần dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy. Mẫu cấy được ngập trong mơi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì.
Trong suốt thời gian mẫu cấy ngập trong mơi trường lỏng, khơng khí được cung cấp vào bình nuơi cấy dưới dạng những bọt khí, mơi trường được chuyển động làm cho mẫu cấy xoay trở được các mặt tiếp xúc với mơi trường làm mới khơng gian nuơi cấy. Áp suất vượt mức sau đĩ được thốt ra bên ngồi qua một màng lọc khí ở trên nắp bình.
Hình 1.2. Quy trình hoạt động của hệ thống RITA®: Pha 1: mơ cấy khơng ngập trong mơi trường;
SVTH: Đào Thị Lý -56-
Pha 2: hiện tượng ngập được hoạt hĩa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy mơi trường lỏng lên ngập mơ cấy;
Pha 3: sự trao đổi khí trong hệ thống RITA;
Pha 4: chu kỳ kết thúc, các van đĩng lại và mơi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới.
Hình 1.3. Hệ thống RITA®- Bioreactor 1.3.4.2. Hệ thống bình sinh đơi BIT®
Hệ thống bình sinh đơi BIT® (xem hình 1.4) được thiết kế bởi Escalona và cộng sự (1998) được dự định nhân giống số lượng lớn qua con đường phát sinh phơi soma.
Đối với nhân giống theo con đường phát sinh cơ quan kích thước mẫu cấy địi hỏi một hệ thống cĩ thể tích lớn hơn và rẻ hơn. Con đường dễ dàng nhất để đạt được trạng thái ngập tạm thời theo chu kỳ nhất định là nối hai bình thủy tinh hay plastic cĩ kích thước từ 250 ml - 10 l bằng một hệ thống ống dẫn, và điều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa mơi trường vào bình chứa mẫu và ngược lại. Hệ thống BIT® được thiết kế đáp ứng với những yêu cầu trên.
SVTH: Đào Thị Lý -57-
Hình 1.4. Hệ thống bình sinh đơi BIT® 1.3.4.3. Hệ thống Plantima®
Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA® tuy nhiên cĩ thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc. Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi Cơng ty A-tech Bioscientific tại đảo Đài Loan.
SVTH: Đào Thị Lý -58-
Hình 1.6. Hệ thống Plantima® đầy đủ 1.3.5. Ưu và nhược điểm của hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời 1.3.5.1. Ưu điểm
Hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời TIS cĩ tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh phơi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau.
Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi của cây được nuơi cấy trong hệ thống ngập tạm thời luơn cao hơn so với những cây nuơi cấy trong hệ thống thơng thường trên mơi trường rắn hay trong những hệ thống bioreactor thơng thường.
Cây tái sinh và phơi soma thu được trong hệ thống này luơn cĩ chất lượng tốt hơn. Từ đĩ cây cĩ nguồn gốc từ hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời cĩ tỷ lệ sống sĩt cao, sinh trưởng khỏe mạnh trong quá trình thuần hố ngồi vườn ươm.
Cĩ thể nĩi hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời đã kết hợp thành cơng những ưu điểm của hệ thống nuơi cấy rắn thống khí và hệ thống nuơi cấy lỏng giúp cây tránh được những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thơng thống của mơi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên mơi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng.
Chu kỳ và tần số ngập là những chỉ số chủ yếu ảnh hưởng đến sự phát triển của mẫu cấy cũng như tồn bộ quy trình nhân giống. Khi những chỉ số này được tối ưu hĩa, sản lượng sẽ được gia tăng, quá trình kiểm sốt sự phát sinh hình thái tốt hơn và
SVTH: Đào Thị Lý -59-
cịn cĩ khả năng hạn chế tối đa hiện tượng thủy tinh thể. Đây là ưu điểm lớn nhất của hệ thống TIS so với hệ thống bioreactor thơng thường.
Hệ thống TIS tiết kiệm được cơng lao động và khơng gian phịng nuơi cấy và giảm được chi phí sản xuất. Những quá trình nhân nhanh phơi soma, tái sinh nhiều chồi, tạo củ bi cĩ khả năng được tối ưu hố trên nhiều đối tượng cây trồng từ đĩ giảm được chi phí sản xuất một cách đáng kể.
1.3.5.2. Nhược điểm
Mật độ nuơi cấy là một yếu tố khơng kém phần quan trọng nhưng hiện nay vẫn chưa được khảo sát một cách sâu rộng. Thời gian ngập tối ưu phải được khảo sát và xác định chính xác cho từng giai đoạn nuơi cấy của từng loại cây cũng như thời gian giữa các lần cấy chuyền đối với những hệ thống khơng thể bổ sung mơi trường mới, cuối cùng là phải khảo sát tối ưu hĩa thành phần mơi trường cho từng giai đoạn nuơi cấy.
Hiện nay, nhiều nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời về mặt vật lý là rất cần thiết để cĩ thể tối ưu hĩa điều kiện nuơi cấy trong những hệ thống này.
Trong điều kiện Việt Nam hiện nay, giá thành của những hệ thống nuơi cấy