5. Phương pháp nghiên cứu
1.1.4.3. Một số hệ thống nuơi cấy in vitro mới
SVTH: Đào Thị Lý -27-
Đây là phương pháp nuơi cấy thực vật bằng mơi trường lỏng, bình nuơi cấy được đặt trên máy lắc (shaker), tuỳ vào mục đích nuơi cấy, đối tượng nuơi cấy mà số vịng quay của máy lắc được điều chỉnh khác nhau (từ 90 - 180 vịng/phút).
Thuận lợi của nuơi cấy lỏng lắc:
Phương pháp nuơi cấy mơ và tế bào thực vật bằng mơi trường lỏng sẽ khắc phục được một số nhược điểm khi nuơi cấy trên mơi trường bán rắn:
Các mẫu nuơi cấy được ngập và phân bố theo khơng gian 3 chiều nên tiết kiệm được khơng gian, mẫu cấy hấp thụ hết mơi trường dinh dưỡng trong bình nuơi cấy. Tăng cường được sự thống khí nên kích thích mẫu phát triển nhanh.
Khi nuơi cấy ngập và được di chuyển tự do trong mơi trường, hiệu ứng ưu thế ngọn bị biến mất và các chồi phát triển tương đối đồng đều nhau. Giảm chi phí sản xuất thơng qua việc giảm được lượng agar sử dụng cho mơi trường nuơi cấy.
Khĩ khăn của nuơi cấy lỏng lắc:
Khĩ khăn lớn nhất của nuơi cấy lỏng lắc là mẫu mơ nuơi cấy bị tổn thương do quá trình lắc. Những khối mơ hay cơ quan tế bào thực vật mới hình thành cịn non yếu, nếu bị va đập mạnh sẽ làm dập nát khối mơ non. Từ đĩ khả năng nhân nhanh tế bào bị giảm sút.
Quá trình nhân nhanh khối mơ hay tế bào sử dụng mơi trường lỏng thay cho mơi trường bán rắn kể từ giai đoạn tái sinh đến giai đoạn tăng sinh khối. Mơi trường nuơi cấy lỏng thường dẫn đến sự phát sinh hình thái bất thường, chẳng hạn như hiện tượng thủy tinh thể (hyperhydricity hay vitrification).
Cho đến nay, định nghĩa về hiện tượng thủy tinh thể vẫn chưa được rõ ràng. Nĩi chung, đây là một hiện tượng liên quan đến sự rối loạn trong hình thái và sinh lý
của thực vật trong quá trình tăng trưởng in vitro, kết quả làm mất đi khả năng phát
triển bình thường, và sau đĩ kéo theo hàng loạt các vấn đề trong suốt quá trình thích nghi của thực vật khi ra vườn ươm.
Biểu hiện của thực vật được nuơi cấy trong mơi trường lỏng là thường yếu ớt, xuất hiện các tinh thể nước giống như thủy tinh, mọng nước ở lá và ở chồi, hệ rễ phát triển kém. Lá là cơ quan chịu ảnh hưởng nhiều nhất trong mơi trường lỏng. Chúng phát triển một loại nhu mơ vơ tổ chức, loại này được tạo ra từ các lớp nhu mơ xốp cĩ khơng gian liên bào rộng, một loại mơ mạch khơng định hình, một lớp biểu bì bất
SVTH: Đào Thị Lý -28-
thường. Lớp mơ biểu bì của các lá thừa nước thường phát triển khơng tốt và quá trình đĩng mở khí khẩu khơng cịn ổn định như trước.
Hậu quả của hiện tượng thủy tinh thể là lá ít phát triển trong điều kiện in vitro cũng như ex vitro và cĩ thể cả cây cũng vậy, thường yếu và chết. Do vậy, khi hiện
tượng thủy tinh thể xảy ra thì chức năng quang hợp cũng như hơ hấp của lá cĩ thể khơng cịn thực hiện được tốt như trước nữa, nên cây sau khi chuyển ra đất thường ít khả năng sống sĩt và kém phát triển.
Sau khi nhân giống in vitro, các cây xuất hiện hiện tượng bất thường về kiểu hình và cấu trúc giải phẫu, ở giai đoạn ex vitro thường cĩ hiện tượng bất thường về
kiểu hình. Các biểu hiện sai hỏng, chẳng hạn như thừa nước, lá và chồi kém phát triển, phơi bất thường, rối loạn quá trình phát sinh phơi đều là kết quả của sự gián đoạn hay mất tín hiệu trong trình tự của quá trình tái tạo cơ quan ở thực vật. Các vấn đề nêu trên biểu hiện nghiêm trọng hơn đối với nuơi cấy lỏng và cần phải cĩ những nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ cũng như cĩ thể kiểm sốt được sự phát sinh hình thái trong nuơi cấy bioreactor - một mơ hình lớn của nuơi cấy lỏng.
b. Nuơi cấy bằng bioreactor
Đây là phương pháp nuơi cấy dựa trên một bình nuơi cấy được thiết kế chuyên biệt nhằm mục đích nhân số lượng lớn tế bào, mơ hay cơ quan trong mơi trường lỏng cĩ hệ thống làm thống khí.