5. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Các thao tác trong phịng cấy
Rửa sạch tay bằng xà bơng trước khi thao tác, mặc áo blouse, nĩn, khẩu trang và mang găng tay.
Khử trùng tủ cấy trước khi thao tác cấy mẫu: lau kỹ tủ cấy bằng cồn 70o; bật đèn UV thời gian 15 phút, tặt đèn UV và khởi động tủ cấy.
Các thao tác trong tủ cấy:
- Lau cồn 70o các bioreactor đựng mơi trường, chai mẫu và các vật dụng bằng trước khi đưa vào tủ cấy.
- Đốt các dụng cụ giải phẫu bằng cồn 96o sau mỗi lần thay đổi thao tác và gác lên kệ để nguội mới tiến hành tách hoặc cấy chồi.
- Các mẫu cấy bị rơi trên mặt bàn khơng được sử dụng cấy lại.
- Hơ kỹ miệng và nắp hộp bioreactor trước và sau khi cấy mẫu, thao tác cấy mẫu phải nhanh nhẹ.
- Khi cấy hạn chế vơ tay qua mẫu nhằm hạn chế nhiễm nấm; - Tránh để tay mới lau cồn gần đèn cồn khi đang cháy.
- Vệ sinh sạch sẽ tủ cấy bằng cồn 70o sau khi kết thúc cơng việc. 2.2.3. Cách bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên, gồm 6 nghiệm thức mơi trường, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, thực hiện trên hai giống lan Hồ điệp
SVTH: Đào Thị Lý -73-
Cơng thức mơi trường thí nghiệm: gồm 6 cơng thức Ký
hiệu
Sự thay đổi nồng độ khống đa lượng trong mơi trường nuơi cấy MS (Murashige & Skoog, 1962)
Các chất bổ sung
S1 ½ KĐL trong suốt 8 tuần nuơi cấy S2 ¼ KĐL trong suốt 8 tuần nuơi cấy
S3 ¼ KĐL trong 4 tuần đầu và ½ KĐL cho 4 tuần sau S4 ¼ KĐL trong 2 tuần đầu, ½ KĐL từ tuần thứ 4 đến
tuần thứ 6 và 1 KĐL cho tuần thứ 8 S5
1
KĐL (giữ nguyên hàm lượng các KĐL trong suốt 8 tuần nuơi cấy)
S6
0
KĐL trong 2 tuần đầu, ¼ KĐL tuần thứ 4, ½ KĐL tuần thứ 6 và 1 KĐL tuần thứ 8 1mg/ml BA 0,5mg/l NAA 500mg/l PVP 1000mg/l tryptone 30000mg/l sucrose
Ghi chú: KĐL = khống đa lượng: NH4NO3, KNO3, Mg2SO4.7H2O, CaCl2.2H2O và KH2PO4.
Sự thay đổi nồng khống đa lượng trong mơi trường nuơi cấy MS sử dụng
trong thí nghiệm nhân chồi lan Phalaenopsis Yubidan và lan Dendrobium Sonia,
thực hiện trong hệ thống TIS như:
Nồng độ khống đa lượng trong mơi trường MS Ký hiệu mơi
trường 2 tuần 4 tuần 6 tuần 8 tuần
S1 ½ ½ ½ ½ S2 ¼ ¼ ¼ ¼ S3 ¼ ¼ ½ ½ S4 ¼ ½ ½ 1 S5 1 1 1 1 S6 0 ¼ ½ 1
SVTH: Đào Thị Lý -74-
Chọn chồi phát triển bình thường, cĩ 3 lá, lá màu xanh đậm; Cân khối lượng tươi 25 chồi ban đầu trước khi vơ mẫu;
Thể tích mơi trường lỏng sử dụng trong mỗi hộp bioreactor là 150 ml; Chu kỳ ngập mơi trường 4 giờ/lần, thời gian ngập 4 phút;
Chu kỳ nhân chồi là 8 tuần;
Chu kỳ thay mơi trường 2 tuần/lần;
Điều kiện phịng nuơi: ánh sáng đèn huỳnh quang, cường độ ánh sáng 1800 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ phịng nuơi 25oC (± 2oC), ẩm độ phịng 30%.
Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, hấp 20 phút đối với mơi trường nuơi và 30 phút đối với dụng cụ.
Sử dụng van lọc khuẩn 0.2 µm và 0.45 µm. 2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khống đa lượng đến sự hình thành và phát
triển của chồi lan Phalaenopsis Yubidan.
2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khống đa lượng đến sự hình thành và phát
triển của chồi lan Denrobium Sonia.
2.4. Các chỉ tiêu theo dõi.
Các thí nghiệm theo dõi 2 tuần/lần đồng thời với chu kỳ thay mơi trường nuơi cấy: 1. Xác định tỉ lệ chồi sống qua các chu kỳ nuơi: đếm số chồi sống và số chồi
chết/ bioreactor sau 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần nuơi cấy.
2. Xác định số chồi mới hình thành: đếm số chồi mới hình thành/ bioreactor sau 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần nuơi cấy.
3. Xác định khối lượng chồi tươi của các nghiệm thức: cân tất cả các chồi cịn sống/ bioreactor sau 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần nuơi cấy.
4. Theo dõi và ghi nhận khả năng tái tạo và phát triển của chồi ở các nghiệm thức thí nghiệm
- Quan sát sự thay đổi màu sắc, kích thước chồi, lá so với ban đầu và với các nghiệm thức khác sau các chu kỳ thay mơi mơi trường;
- Quan sát số lá/ chồi mới hình thành sau 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần nuơi cấy;
SVTH: Đào Thị Lý -75-
- Sự xuất hiện các biến dị ở các nghiệm thức. 2.5. Phân tích thống kê.
Các kết quả thí nghiệm xử lý thống kê theo phương pháp phân tính phương sai theo bảng Anova. So sánh kết quả và xếp hạng theo phương pháp Duncan. Sử dụng phần mềm xử lý thống kế MSTATC và Microsoft Excel.
CHƯƠNG 3:
KẾT QUẢ – THẢO LUẬN
3.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khống đa lượng đến sự hình
thành và phát triển của chồi lan Phalaenopsis Yubidan.
Trong nuơi cấy mơ vi nhân giống cây trồng, chồi là cung đoạn rất quan trọng trong qui trình sản xuất cây giống. Hệ số nhân chồi và chất lượng chồi cĩ ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng và chất lượng cây giống và cuối cùng là chất lượng thương mại của sản phẩm hoa. Đối với lan Hồ điệp, thuộc lồi thân đơn, hệ số nhân chồi
SVTH: Đào Thị Lý -76-
trong mơi trường thạch truyền thống thường thấp. Sự tái sinh chồi cũng như chất lượng của chồi phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong mơi trường nuơi cấy. Đặc biệt là các yếu tố đa lượng như N, P, K và chất điều hồ sinh trưởng như auxin hay cytokinine tuy nhiên sử dụng chất điều hồ sinh trưởng cĩ thể gây biến dị chồi, ảnh hưởng đến chất lượng cây giống và hoa sản phẩm. TIS là một kỹ thuật cơng nghệ mới, sử dụng mơi trường lỏng để nhân chồi lan, rất ít tài liệu nghiên cứu trong lĩnh vực này, đặc biệt là nồng độ các khống đa lượng trong mơi trường nhân chồi.
Đề tài tiến hành thí nghiệm với các nồng độ khống đa lượng thay đổi khác nhau trong mơi trường nuơi cấy MS lỏng. Nồng độ khống đa lượng thay đổi từ 0, ¼,
½ và 1 đối với giống lan Hồ điệp (Phalaenopsis Yubidan) trong hệ thống nuơi cấy
ngập tạm thời TIS. Kết quả thực hiện thí nghiệm trên bảng 3.1.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng các nồng độ khống đa lượng đến khả năng hình thành chồi
lan Phalaenopsis Yubidan.
Số chồi lan hình thành qua các giai đoạn Stt Kí hiệu mơi
trường 2 tuần 4 tuần 6 tuần 8 tuần
1 S1 41a 74ab 110b 150b 2 S2 38ab 47c 83c 99c 3 S3 34c 47c 83c 114c 4 S4 37bc 84a 150a 200a 5 S5 36bc 60bc 64c 87c 6 S6 30d 56c 73c 91c Cv(%) 6.18 15.02 12.71 15.71 LSD(0.05) 3.934 16.14 21.08 35.02
SVTH: Đào Thị Lý -77-
Ghi chú: Những chữ giống nhau trên cùng một cột, giá trị khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống
kê với P = 0.05 trong Duncan’s test.
Số chồi mẫu ban đầu là 25 chồi/bioreactor
Trên bảng 3.1 cho thấy ngay từ 2 tuần đầu nuơi cấy, số chồi mới gần như khơng hình thành trên mơi trường khơng cĩ khống đa lượng. Cụ thể mơi trường S6 số chồi hình thành rất thấp chỉ xuất hiện 5 chồi. Tuy nhiên số chồi gia tăng này khơng phân bố đồng đều trên các chồi mẫu mà chỉ xuất hiện cục bộ trên một vài chồi. Điều này cĩ thể một số chồi mẫu ban đầu đã cĩ mầm mống của chồi nách trước khi đưa vào nuơi cấy. Như vậy, chứng tỏ các khống đa lượng đĩng vai trị rất quan trọng trong quá trình hình thành chồi lan. Điều này cũng thể hiện rất rõ giai đoạn 4 tuần nuơi cấy, ở các cơng thức S2, S3 và S6 cĩ nồng độ khống đa lượng thấp (¼ KĐL), số chồi mới hình thành rất thấp so với các cơng thức khác cĩ nồng độ khống đa lượng cao hơn, đặc biệt là ½ KĐL như mơi trường S1 và S4.
Sự gia tăng chồi mới ở giai đoạn 6 tuần và 8 tuần nuơi cấy vẫn tiếp tục tăng cao rất cĩ ý nghĩa ở mơi trường S1 và S4. Điều đáng lưu ý ở đây là mơi trường S5, nồng độ các khống đa lượng khơng thay đổi so với mơi trường MS cơ bản (1 KĐL) trong suốt thời gian 8 tuần nuơi cấy lại cĩ số chồi hình thành thấp nhất. Trong khi mơi trường S1 cũng duy trì một nồng độ khống đa lượng trong suốt thời gian nuơi cấy (nồng độ khống đa lượng ½) lại cho số chồi cao. Điều này chứng tỏ nếu giảm ½ khống đa lượng trong mơi trường nuơi cấy MS cơ bản sẽ làm tăng khả năng tạo chồi lan Hồ điệp. Kết quả này cũng trùng hợp với nghiên cứu của Hempfling Tino và Preil Walter (2005), Yeh D. M. và cộng sự (2007), và Cung Hồng Phi Phượng (2007) sử dụng mơi trường MS lỏng ½ khống đa lượng trong nhân chồi lan Hồ điệp.
Nếu thay đổi nồng độ khống đa lượng trong mơi trường MS theo hướng tăng dần ở mức ¼ tại các giai đoạn nuơi cấy 2, 4, 6, và 8 tuần như mơi trường S4 (¼ KĐL trong 2 tuần đầu, ½ KĐL từ tuần thứ 4 đến tuần thứ 6 và 1 KĐL cho tuần thứ 8) thì khả năng tạo chồi là cao nhất. Điều này cĩ thể nhận xét rằng sự thay đổi nồng độ khống đa lượng ở các chu kỳ nhân chồi sẽ gĩp phần kích hoạt sự hình thành chồi của lan Hồ điệp trong hệ thống TIS.
SVTH: Đào Thị Lý -79- S 1 S 2 S 3 S 4 S 5 S 6
Hình 3.1: Sự hình thành và phát triển của chồi lan Phalaenopsis Yubidan sau
SVTH: Đào Thị Lý -80-
Đối với cây trồng, khống đa lượng khơng những tham gia vào quá trình hình thành nên chồi mà cịn tham gia vào sự tăng trưởng (tăng trọng) của chồi. Tuỳ thuộc vào thành phần và nồng độ khống khác nhau trong mơi trường dinh dưỡng mà sự ảnh hưởng đến sự tăng trọng của chồi khác nhau.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng các nồng độ khống đa lượng đến sự tăng trọng chồi lan
Phalaenopsis Yubidan.
Khối lượng chồi (g) Stt
Kí hiệu mơi
trường 2 tuần 4 tuần 6 tuần 8 tuần
Đặc tính tăng trưởng của chồi
1 S1 4.56bc 8.16ab 14.95ab 23.88a Chồi lớn, cĩ 3 lá, xanh đậm
2 S2 4.30bc 5.87c 8.07c 12.09c
Chồi lớn, khơng đều, cĩ 1-3 lá màu xanh tím, xuất hiện nhiều rễ và dài.
3 S3 3.98c 6.03bc 9.50c 17.47bc Chồi nhỏ, khơng đều, cĩ 1-3 lá, màu xanh, tím, cĩ rễ. 4 S4 6.02a 8.71a 16.14a 22.50ab Chồi nhỏ, đều, cĩ 2-3 lá, lá
xanh đậm
5 S5 5.16ab 8.10ab 11.70bc 16.08c Chồi lớn, cĩ 3-5 lá, lá to, lá bị xoăn, xanh đậm, cĩ rễ lớn. 6 S6 3.90c 5.10c 8.38c 13.43c Chồi nhỏ, khơng đều, màu
xanh đậm, cĩ rễ.
Cv(%) 13.95 16.86 18.21 18.20 LSD(0.05) 1.125 2.091 3.727 5.885
Ghi chú: Những chữ giống nhau trên cùng một cột, giá trị khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê với P = 0.05
Kết quả bảng 3.2 cho thấy, sau 4 tuần nuơi cấy chồi lan Phalaenopsis Yubidan
với nồng độ khống đa lượng cao (½ KĐL hay 1 KĐL) thì chồi đạt trọng lượng tươi cao. Cụ thể mơi trường S1, S4 và S5. Nhưng qua 4 tuần nuơi cấy tiếp theo, mơi
SVTH: Đào Thị Lý -81-
trường S5 (với 1 KĐL trong suốt 8 tuần nuơi cấy) cĩ khối lượng chồi tươi thấp nhất. Chồi phát triển khơng đều, lá bị xoăn lại và cĩ màu xanh đậm, xuất hiện rễ to và dài.
Cĩ thể nĩi khống đa lượng khơng những ảnh hưởng đến sản lượng chồi lan Hồ điệp mà cịn đến trọng lượng tươi của chồi. Với các nồng độ khống đa lượng khác nhau sẽ ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển chồi khác nhau.
Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự hình thành và phát triển chồi lan hồ điệp
23.9 12.1 17.5 22.5 16.1 13.4 0 50 100 150 200 250 S1 S2 S3 S4 S5 S6 Môi trường số chồi khối l ượng chồi (g)
Biểu đồ 3.1 cho thấy mơi trường S1 và mơi trường S4 khơng chỉ cho số chồi cao nhất mà khối lượng chồi lan Hồ điệp ở hai mơi trường này cũng đạt ở mức cao điều này phần nào phản ánh được chất lượng chồi của hai mơi trường này. Tuy nhiên xét về mặt năng suất và chất lượng chồi thì mơi trường S1 cĩ phần ưu thế hơn, bởi số chồi lan hình thành trong mơi trường này thấp hơn mơi trường S4 nhưng khối lượng chồi lan ở mơi trường này vẫn cao tương đương với mơi trường S4. Điều này chứng tỏ chất lượng chồi của mơi trường S1 ưu thế hơn mơi trường S4. Kết quả này đã được ghi nhận trong bảng 3.2: chồi lớn, đồng đều, cĩ 3 lá, màu xanh đậm. Trong khi đĩ các chồi ở mơi trường S4 cĩ nhiều chồi đa số cĩ 2 lá. Điều này cũng trùng với kết quả nghiên cứu của Cung Hồng Phi Phượng (2007) về khảo sát mật độ nuơi cấy
chồi lan Phalaenopsis trên mơi trường MS ½ trong hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời
Plantima đã xác nhận với mật độ từ 20-30 chồi lan hồ điệp cho chất lượng chồi tốt nhất.
SVTH: Đào Thị Lý -82-
Tuy nhiên số chồi đạt được vẫn thấp hơn so với nghiên cứu của Hempfling Tino và Preil Walter (2005) là do tác giả sử dụng hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời
kiểu bình sinh đơi loại 5 lít để nhân chồi giống Phalaenopsis cv.Jaunina trên mơi
trường MS ½ cĩ bổ sung TDZ 0.5 mg/l cho tỷ lệ nhân chồi là 25.4 sau 12 tuần nuơi cấy. Tỷ lệ nhân chồi của đề tài thấp hơn nhiều, sự khác biệt này là do: hệ thống nuơi cấy của Hempfling rộng hơn đã tạo khơng gian tốt cho khả năng nhân chồi; hoặc do thời gian nuơi cấy của Hempfling dài hơn; cũng cĩ thể là do sự bổ sung chất điều hịa sinh trưởng khác với đề tài (sử dụng BA, NAA); hay cĩ thể do thí nghiệm thực hiện trên 2 giống lan Hồ điệp khác nhau;...
Cùng với nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng nồng độ khống trên mơi trường khống MS cơ bản đối với sự hình thành và phát triển chồi cây Bạch mã hồng tử
(Aglaonema ’White Tip’) trong hệ thống TIS. Yeh D. M. và cộng sự (2007) cũng đã
chứng minh rằng nồng độ khống MS ½ cĩ tỷ lệ nhân chồi cao và khối lượng chồi cao nhất so với nồng độ khống MS cơ bản hay nồng độ khống đa lượng gấp 2 lần so với mơi trường MS cơ bản. Như vậy, giảm ½ khống đa lượng trong mơi trường nuơi cấy MS cơ bản sẽ làm tăng khả năng tạo chồi và trọng lượng của chồi cây Bạch
mã hồng tử cũng như chồi lan Phalaenopsis Yubidan được thực hiện ở đề tài này. Từ đấy cho thấy rằng hệ thống TIS nhân chồi lan Phalaenopsis Yubidan ở nồng độ
½ KĐL sẽ cho kết quả hình thành chồi mới và khối lượng chồi đạt ở mức cao. Đặc biệt các mơi trường cịn lại như mơi trường S2, S3 và S6, vì khơng cung cấp đầy đủ lượng khống đa lượng đúng thời điểm chồi cần nên sức sống chồi kém và số chồi hình thành ít kéo theo trọng lượng tươi của chồi thấp.
Tĩm lại, S1 và S4 là hai mơi trường thích hợp nhân nhanh chồi lan
Phalaenopsis Yubidan trong hệ thống nuơi cấy ngập tạm thời (TIS). Tùy vào mục
đích của nhà sản xuất giống mà chọn lựa mơi trường thích hợp cho quy trình nhân giống Lan Hồ điệp. Nếu nhà sản xuất chú trọng đến năng suất chồi tạo thành thì mơi trường S4 là tối ưu nhất, cịn nhà sản xuất yêu cầu năng suất và phẩm chất chồi tạo thành thì áp dụng mơi trường S1 là tốt nhất.
SVTH: Đào Thị Lý -84- S 1 S2 S4 S3 S6 S5
Hình 3.2: Đặc tính sinh trưởng của chồi lan Phalaenopsis Yubidan sau 8
SVTH: Đào Thị Lý -85-
3.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khống đa lượng đến sự hình
thành và phát triển của chồi lan Dendrobium Sonia
Để đánh giá ảnh hưởng của khống đa lượng đối với các giống lan khác nhau
đề tài đã thực hiện đồng thời trên giống lan Dendrobium, với các nồng độ khống đa