5. Phương pháp nghiên cứu
1.2. HỆ THỐNG BIOREACTOR TRONG NUƠI CẤY MƠ THỰC VẬT
1.2.1. Giới thiệu chung
Tự động hĩa sự phát sinh cơ quan trong bioreactor được đặt lên hàng đầu như là một phương pháp khả thi trong việc làm giảm chi phí của vi nhân giống thương mại (Takayama và Akita, 1994; Leathers et al., 1995; Paek et al., 2002). Nhân giống trên quy mơ lớn thực vật qua nuơi cấy phơi, mơ và tế bào bằng bioreactor đang cĩ nhiều triển vọng trong nhân giống cây trồng quy mơ cơng nghiệp.Bioreactor sử dụng trong nuơi cấy mơ tế bào thực vật được cải tiến từ các loại bioreactor trong nuơi cấy tế bào vi sinh.
Việc sử dụng bioreactor cho nhân giống thực vật được báo cáo đầu tiên vào
năm 1981 với nghiên cứu của tác giả Takayama trên đối tượng là cây Begonia (cây
thu Hải Đường). Về sau, hệ thống này cịn được ứng dụng cĩ hiệu quả trên nhiều lồi thực vật khác (Takayama, 1991).
Sử dụng một bioreactor cỡ nhỏ (từ 4 - 10 lít) trong khoảng 1 - 2 tháng cĩ thể tạo ra đến 4.000 - 20.000 cây con. Điều này cho thấy khả năng và triển vọng to lớn của việc áp dụng hệ thống bioreactor trong vi nhân giống thương mại đồng thời mở ra một hướng mới trong sản xuất các sản phẩm cĩ hoạt tính sinh học cĩ nguồn gốc thực vật (Takayama, 1991).
SVTH: Đào Thị Lý -31-
Mục đích của nuơi cấy bioreactor là tăng nhanh số lượng lớn các chồi đồng
nhất và đồng thời giúp giảm chi phí trong nhân giống thực vật (Nhut và cộng sự,
2004).
Bioreactor được mơ tả là một bình phản ứng cĩ những tính chất sau: nuơi cấy trong điều kiện vơ trùng, nuơi cấy trong mơi trường lỏng, số lượng mẫu cấy nhiều, cĩ khả năng tự động hĩa, vi tính hĩa thơng qua vi điều khiển các yếu tố mơi trường như mức độ khuấy trộn, thống khí, nhiệt độ, oxy hịa tan, pH,…
Nuơi cấy bằng bioreactor là một trong những phương pháp đầy hứa hẹn cho nhân giống với số lượng lớn tế bào, phơi soma hay các đơn vị phát sinh cơ quan (củ, hành, đốt, củ bi hay cụm chồi), trong đĩ đã cĩ một số báo cáo về nhân giống các loại cây hoa cảnh và cây dược liệu bằng bioreactor.
Tuy nhiên, sự mâu thuẫn trong việc tối ưu các loại bioreactor cũng như các thơng số nuơi cấy cũng được nêu lên. Nguyên nhân chính là do sự khác nhau về lồi, do đĩ cần phải quan sát cẩn thận từng trường hợp cụ thể. Khi chuẩn bị nuơi cấy trên một đối tượng nào đĩ, thơng thường bắt đầu với hệ thống bioreactor nhỏ để tối ưu hĩa các điều kiện nuơi cấy, sau đĩ việc nuơi cấy trong các bioreactor (500 – 1000 lít) quy mơ lớn dễ dàng thực hiện hơn.
1.2.2. Cấu trúc và phân loại bioreactor 1.2.2.1. Cấu trúc bioreactor 1.2.2.1. Cấu trúc bioreactor
Cĩ nhiều kiểu bioreactor khác nhau. Chúng được phân biệt theo dạng: phương pháp khuấy, theo kiểu bầu chứa, theo kiểu sục khí, theo chế độ chiếu sáng (Takayama, 1991). Xét về cấu tạo chung thì bioreactor nuơi cấy mơ thực vật cũng giống bioreactor nuơi cấy tế bào động vật hay vi sinh vật.
SVTH: Đào Thị Lý -32-
Hình 1.1. Mơ hình bioreactor được nối với cánh khuấy cĩ mơ-tơ.
Vào khoảng cuối năm 1950, các nhà khoa học đã thiết kế nhiều kiểu bồn lên men (fermenter). Các kiểu đơn giản được thiết kế vào năm 1959, bao gồm bình 20 lít. Bình này cĩ một nút cao su lớn và 4 ống nhỏ (ống cho khí vào, ống khí ra, ống mơi trường vào, ống lấy mẫu ra). Hệ thống chai quay được thiết kế năm 1964.
Hiện nay, tuy kích thước bioreactor nuơi cấy tế bào thực vật khơng ngừng tăng lên nhưng cấu trúc của chúng vẫn tương tự các bồn lên men vi sinh vật.
Bioreactor là một mơ hình nuơi cấy phù hợp nhất cho nuơi cấy mơ thực vật trong việc sản xuất nhanh một số lượng lớn cây con trong một mẻ nuơi cấy. Các loại bioreactor được sử dụng phổ biến là loại cĩ thể tích 2 - 20 lít vì chúng cĩ một số thuận lợi sau:
- Dễ dàng vận hành - Cĩ thể vơ trùng dễ dàng - Giá thành thấp
- Ít gây hậu quả nghiêm trọng khi bị nhiễm - Kích thước nhỏ
- Tạo ra từ 1- 10.000 cây con trong một mẻ 1. Cửa nạp nguyên liệu
3. Hệ thống sục khí 4. Ống dẫn nước 5. Ống thốt nước 6. Motor 7. Đai bảo vệ 8. Thanh truyền động 9. Cánh quạt 10. Bộ phận cảm biến 11. Vách ngăn 12. Lớp giữ nhiệt
SVTH: Đào Thị Lý -33-
Gần đây các bioreactor 500 lít được sản xuất để sản xuất chồi Stevia
rebaudiana (cây cỏ ngọt) và tạo ra khoảng 200.000 cây con trong 1 mẻ nuơi cấy
trước khi chuyển ra đất. 1.2.2.2. Phân loại bioreactor
Cĩ nhiều loại bioreactor được thiết kế nhằm nhiều mục đích khác nhau đối với từng loại cây trồng, kiểu nuơi cấy hay giai đoạn nuơi cấy.
a. Phân loại theo ứng dụng
Bioreactor cĩ ba loại chính được phân biệt như sau:
- Loại dùng để sản xuất sinh khối (sản phẩm là khối tế bào, các đơn vị phát sinh phơi, phát sinh cơ quan, chồi, rễ).
- Loại dùng để sản xuất các chất chuyển hĩa thứ cấp, enzyme.
- Loại dùng cho việc chuyển hố sinh học các chất chuyển hĩa ngoại sinh (là các chất tiền thân trong quá trình trao đổi chất).
b. Phân loại theo chức năng hoạt động của bioreactor
Xét về chức năng hoạt động thì các bioreactor nuơi cấy thực vật cĩ thể chia thành 2 loại chính sau:
- Loại nuơi cấy ngập cục bộ hay tạm thời. - Loại nuơi cấy ngập tồn bộ hay liên tục.
Loại sau thường được dùng trong vi nhân giống cĩ mật độ mẫu cấy cao khi mà sự ngập khơng ảnh hưởng lớn đến sự phát triển bình thường của mẫu cấy. Chẳng hạn khi nuơi cấy protocorm-like body, mơ sẹo tạo phơi, phơi soma, cụm mơ phân sinh và các chồi mắt. Nuơi cấy ngập hồn tồn cũng thích hợp cho nuơi cấy các thân hành và thân củ (Takayama, 1991).
c. Phân loại theo sự di chuyển của mẫu nuơi cấy
Các bioreactor cũng được phân loại thành 3 kiểu dựa vào sự di chuyển của mẫu nuơi cấy như sau:
- Mẫu nổi ngay sát bề mặt mơi trường (các cây Dâu tây con). - Mẫu lơ lửng trong mơi trường (cây Thu hải đường, cây Hơng).
- Mẫu chìm ở đáy bioreactor (cây Huệ tây, cây hoa Lay-ơn, cây Khoai tây). Trong 3 kiểu trên, kiểu cĩ mẫu nổi và chìm cho thấy cĩ sự phát triển rất tốt. Trong trường hợp mẫu lơ lửng, di chuyển trong mơi trường dễ bị tổn thương hư hại
SVTH: Đào Thị Lý -34-
nghiêm trọng. Nguyên nhân là do di chuyển chúng đã va chạm nhau, cái này đè lên cái kia dẫn đến stress (tổn thương) tế bào, kết quả là tăng trưởng bị suy giảm.
d. Phân loại bioreactor theo hình thức khuấy Gồm 3 loại sau:
- Bioreactor khuấy máy. - Bioreactor khuấy hơi nước. - Bioreactor khơng khuấy.
Ngồi ra, cĩ một loại bioreactor cung cấp oxy mà khơng tạo bọt khí bằng cách dùng các ống silicone. Chúng được xem là rất phù hợp với nuơi cấy huyền phù tế bào phát sinh phơi. Và gần đây, cĩ một loại bioreactor acoustoc mist rất hiệu quả trong việc tăng sinh khối của rễ bất định (hairy root) (Ziv, 1999).
1.2.3. Các kiểu bioreactor
1.2.3.1. Bioreactor khuấy bằng cơ học (Mechanically agitated bioreactor) a. Bioreactor khuấy thống khí (Aeration-agitation bioreactor)
Kiểu bioreactor này thường được đề cập dưới dạng những bình phản ứng khuấy trộn (stirred tank bioreactors - STRs) cĩ cánh khuấy chẳng hạn như: tua-bin, chân vịt, mái chèo hay ruy-băng xoắn ốc. Mặc dù STRs cĩ ý nghĩa trong nuơi cấy tạo huyền phù nhưng cũng gây ra những lực khuấy mạnh. Tuy nhiên, gần đây STRs đã được cải tiến nhằm khắc phục các bất lợi trên. Kiểu cánh khuấy ruy-băng xoắn ốc được xem là cĩ hiệu quả đối với nuơi cấy huyền phù tế bào thực vật cĩ mật độ cao và
nuơi cấy tạo phơi soma (Archambault et al., 1994). Nĩi chung, bioreactor dạng này
thường được sử dụng trong nuơi cấy tạo phơi. Nhưng hiện nay vẫn cịn quá ít các nghiên cứu tiến hành so sánh hiệu quả giữa các kiểu bioreactor khác nhau.
b. Bioreactor hình trống quay (Rotating drum bioreactor)
Kiểu bioreactor này gồm cĩ một bình chứa cĩ dạng hình trống được gắn trên một trục quay, trục này cĩ nhiệm vụ nâng đỡ và quay bình chứa. Bình được quay với tốc độ khoảng 2 - 6 vịng/phút nhằm hạn chế tối đa lực xé làm tổn thương tế bào. Một bình phản ứng khơng cĩ tấm ngăn cách cĩ thể được sử dụng trong nuơi cấy tạo cây con thơng qua quá trình tạo chồi và tạo phơi (Takayama và Akita, 1994).
SVTH: Đào Thị Lý -35-
Kiểu bioreactor này cĩ một màng lọc xoay cĩ nhiệm vụ hịa trộn huyền phù nuơi cấy và đồng thời lấy đi mơi trường đã sử dụng và bổ sung mơi trường mới vào. Các màng lọc quay khuấy trộn mơi trường khơng làm xé rách màng tế bào chính là nhờ vào việc tạo ra được những đường khuấy mỏng. Để cĩ thể duy trì được lâu sự tăng trưởng liên tục của mơ sẹo và sự phát triển của phơi trong cơng tác nhân nhanh, người ta đã thiết kế một bioreactor cĩ hai màng lọc cùng quay. Một chiến lược nhằm nuơi cấy hiệu quả là người ta tiến hành nuơi cấy liên tục trong giai đoạn tăng sinh tế bào. Nhằm tạo sự đồng nhất, người ta ổn định điều kiện nuơi cấy cho các tế bào và duy trì được nhĩm tế bào đang tăng trưởng phù hợp cho sự phát triển tạo phơi. Giai đoạn thứ hai của bioreactor là tạo phơi theo chu kỳ. Sự phát triển của phơi cĩ thể được điều khiển thơng qua nguồn dinh dưỡng thiết yếu hoặc các thành phần khí. Việc tạo ra các cây con thơng qua con đường tạo phơi soma cho thấy thích hợp nhất đối với quá trình nhân sinh khối bằng cách sử dụng bioreactor màng lọc xoay.
1.2.3.2. Bioreactor cĩ khuấy và khơng khuấy bằng nén khí (Pneumatically agitated and non-agitated bioreactor)
Đây là kiểu bioreactor đơn giản, được thiết kế với một bộ phận sủi bọt khí ở phía dưới đáy bình, nĩ cĩ nhiệm vụ khuấy trộn mơi trường và cung cấp oxygen (đối với bioreactor sục khí đơn giản, bioreactor tạo bọt dạng hình cột). Trong một số trường hợp, bình nuơi cấy cĩ thể gắn thêm các ống thơng (đối với bioreactor air-lift).
a. Bioreactor air-lift
Kiểu bioreactor này cũng tương tự với bioreactor được khuấy trộn bằng dịng xốy-STRs (nhưng ở đây thì khơng cĩ cánh khuấy). Bioreactor air-lift khắc phục được hai nhược điểm của bioreactor khuấy bằng cánh khuấy đĩ là: ít tốn năng lượng cho việc khuấy trộn mơi trường và ít gây ra lực xé rách các tế bào nhờ những dịng khí nhỏ di chuyển nhẹ nhàng từ phía dưới lên. Sự hịa trộn dịng khí vào trong pha lỏng trở nên cĩ hiệu quả hơn do cĩ sự lưu trú các bong bĩng khí trong mơi trường.
Để cĩ thể tạo được các bọt khí nhỏ mịn, dịng khí phải được thổi qua một màng lọc với những lỗ cĩ kích thước rất nhỏ 0,01 – 0,1 mm. Chính nhờ sự nhỏ mịn của các bong bĩng khí đã làm cho các tế bào giảm đáng kể sự cọ sát nên ít bị tổn thương, nhất là đối với những tế bào cĩ độ nhạy cảm cao.
SVTH: Đào Thị Lý -36-
b. Bioreactor sục khí dạng đơn giản và bioreactor sủi bọt khí dạng hình cột (Simple aeration bioreactor and bubble column bioreactor)
Giống bioreactor air-lift, bioreactor sủi bọt hình cột cũng tạo ra ít sự cọ sát. Điểm khác biệt chủ yếu giữa bioreactor air-lift và bioreactor sủi bọt hình cột là hệ thống tuần hồn và chế độ thủy động lực học. Loại bioreactor này thích hợp cho nuơi cấy nhiều loại cây khác nhau thơng qua quá trình nuơi cấy chồi, thân củ, rễ củ… (Takayama, 1991). Hơn nữa, việc chia bioreactor sủi bọt hình cột thành nhiều phần và cài đặt nhiều bộ phận sủi bọt khí sẽ đẩy nhanh tốc độ tăng sinh khối.
Những hạn chế chung của cả air-lift bioreactor và bioreactor sủi bọt hình cột: a) cĩ bọt nổi lên do tăng cường một lượng khí lớn, b) các tế bào cĩ khuynh hướng bị tống ra khỏi dung dịch bởi bọt khí, c) tế bào lớn lên trên thành của bình nuơi cấy (trong bọt). Số lượng tế bào bên trong bình biểu thị tổng sinh khối của tế bào. Hiện tượng nổi bọt và tăng trưởng trên thành bình do đường kính của bình và nắp bình cĩ cùng kích thước. Vấn đề này đã được giải quyết bằng cách cải tiến bình nuơi cấy như miệng bình cĩ đường kính lớn hơn, hay bình cĩ kiểu dạng cầu.
c. Bioreactor sủi bọt dạng cầu (Ballon type bubble bioreactor – BTBB) Bioreactor dạng này cĩ hình cầu và cĩ nắp ở trên đỉnh. Ở gần đáy của bình cĩ một khĩa hình chữ Y hoặc chữ T cĩ nhiệm vụ châm thêm mơi trường và là cổng thu sản phẩm. Bằng việc sử dụng một thiết bị sủi bọt với các lỗ đồng tâm đặt đáy bình, điều này đã làm cho lượng bọt được giảm. Ngồi ra, trên nắp bình cịn cĩ gắn thêm các thiết bị đo pH và oxy hịa tan. Những bioreactor dạng này được sử dụng trong vi
nhân giống tạo phơi soma (Kim, 1999; Paek et al., 2000).
1.2.3.3. Bioreactor thổi khí trên bề mặt (Overlay aeration bioreactor)
Dạng bioreactor này thổi khí từ trên bề mặt xuống dung dịch lỏng và đơi khi kết hợp với sục khí nhẹ nhưng hệ số oxy hịa tan khá thấp (nhỏ hơn 1). Kiểu bioreactor này được báo cáo là chưa thành cơng lắm trong nuơi cấy mơ.
1.2.3.4. Bioreactor ngập gián đoạn tự động (Automated temporary immmersion bioreactor)
Hệ thống ngập tự động này đã được thương mại dưới tên gọi là “RITA” do Teisson và Alvard thiết kế (1995). Hệ thống bioreactor này gồm hai bình chứa, một
SVTH: Đào Thị Lý -37-
bình dùng cho sự tăng trưởng của thực vật, một bình dùng để chứa mơi trường lỏng. Hai bình này được nối với nhau bằng ống silicon và thủy tinh. Khơng khí nén từ một thiết bị bơm khí sẽ đẩy mơi trường lỏng từ bình chứa thứ nhất sang bình chứa thứ hai, làm ngập hồn tồn mẫu thực vật. Sau đĩ, khí sẽ rút khỏi bình chứa mơi trường, làm cho mơi trường ở bình nuơi cấy hạ xuống.
Trong mỗi trường hợp như vậy, khơng khí được thổi qua một màng lọc vơ trùng với kích thước lỗ 0,2 mm. Một thiết bị điều khiển hẹn giờ được dùng để ấn định khoảng thời gian cho một chu trình dâng lên và hạ xuống. Cĩ một hệ thống van 3 cổng dạng so-le được dùng trong trường hợp điều khiển đĩng mở này. Hệ thống bioreactor này đã được báo cáo là nuơi cấy thành cơng trên một số cây như: cây lê (Damiano và cộng sự, 2000), cây dứa (Esscalo và cộng sự, 1999), cây mía
(José Carlos Lorenzo và cộng sự, 1998) và cây Coffea arabica (Etienne và cộng sự,
1999).
Như vậy, để nhân giống với số lượng lớn đồng thời cả phơi soma và mơ thực vật phát sinh cơ quan một cách cĩ hiệu quả thì cấu trúc bioreactor và thể tích mơi trường phải được thiết lập sao cho phù hợp với các yêu cầu về sự khuấy trộn và hiếu khí của từng loại mơ thực vật được nuơi cấy, cũng như phải làm sao giảm được tối thiểu cường độ cọ sát giữa các mẫu.
1.2.4. Qui trình nhân sinh khối thực vật bằng bioreactor
Qui trình nhân sinh khối thực vật bằng bioreactor gồm các bước sau: a) Bước I: Thiết lập mơi trường nuơi cấy vơ trùng.
b) Bước II: Gồm 2 bước nhỏ.
- Cảm ứng việc tạo nhiều chồi trên một diện tích bề mặt mẫu mơ cấy (nuơi cấy trên mơi trường agar).
- Tăng cường sự phát triển của các chồi bằng kỹ thuật sử dụng bioreactor. c) Bước III: Giúp tạo rễ và làm cứng cáp cây con trước khi đem ra vườn ươm. Trong đĩ:
Bước I: là bước cơ bản cho mọi quá trình nuơi cấy nhằm hạn chế việc nhiễm khuẩn cho mẫu.
SVTH: Đào Thị Lý -38-
Bước II: là bước cảm ứng tạo nhiều chồi bên và chồi bất định trên mẫu mơ nuơi cấy bằng cách cho thêm cytokinin vào mơi trường. Kích thước của các chồi tạo ra quá nhỏ nên khơng thể chuyển sang nuơi cấy bằng bioreactor. Mục đích của bước II là giúp cho các chồi phát triển, tăng trưởng nhanh hơn để tạo thành cây con.
Bước III: là bước giúp tạo rễ và làm cứng cáp cây con, đây là bước cần thiết, tuy nhiên khơng phải áp dụng cho tất cả các lồi, ở một số lồi cĩ thể bỏ qua bước này.
Đây là con đường nhân sinh khối lí tưởng trong nuơi cấy mơ thực vật (Takayama, 1991).
Quá trình nhân giống cho hệ thống nuơi cấy bioreactor như sau: thiết lập điều