5. Phương pháp nghiên cứu
1.2.5. Sự phát triển của thực vật trong bioreactor
1.2.5.1. Quá trình phát sinh phơi soma
Việc sử dụng mơi trường lỏng nuơi cấy tế bào soma để tạo phơi đã được đề cập từ những năm 1958 trên cây cà rốt do Steward và cộng sự tiến hành. Tính tồn thế của tế bào thực vật, khả năng tạo phơi mới và sự biểu hiện kiểu hình là cơ sở để đưa ra giả thiết về sự phân lập và nuơi cấy tế bào thực vật trong mơi trường lỏng, đặc biệt giúp kích thích tạo phơi đơn bội.
Quá trình phát sinh phơi soma được thực hiện bằng cách sử dụng mơi trường kích thích cĩ chứa auxin (thường sử dụng 2,4-D) và nước dừa ban đầu. Sau đĩ dùng nhiều cytokinin, myo-inositol và giảm lượng nitrogen. Khi các cụm tiền phơi được tạo thành thì phải hạ thấp hoặc lấy bớt nồng độ auxin trong mơi trường. Sau đĩ, trình tự giống như quá trình tạo phơi giao tử (đơn bội) sẽ diễn ra.
SVTH: Đào Thị Lý -39-
Quá trình phát sinh phơi soma được quan sát lần đầu tiên ở một chi của họ Umbelliferae được nuơi cấy trong mơi trường lỏng (Steward và cộng sự, 1970). Kể từ đĩ, quá trình này cịn được cơng bố ở nhiều cây hạt trần và cây hạt kín, bao gồm lồi cây cảnh, cây rau và cây lương thực cũng như cây thân gỗ.
Con đường phát sinh phơi đối lập với con đường phát sinh cơ quan. Đây cĩ thể là một hệ thống sản xuất hiệu quả hơn trong việc nhân giống tạo số lượng lớn. Sự phát sinh phơi soma cĩ thể ít bị biến dị. Tuy nhiên, hiện tượng biến dị soma đơn dịng cĩ thể ít xảy ra ở mơ tái sinh trực tiếp nhưng lại thường xảy ra ở các phơi soma phát triển từ mơ sẹo nuơi cấy liên tục. Các phơi đã chứa đầy đủ đỉnh sinh trưởng chồi
và rễ sẽ được chuyển sang giai đoạn ra rễ giống như kỹ thuật nhân giống chồi in vitro
truyền thống.
Phơi soma thường nhỏ và thích hợp cho các qui trình nhân sinh khối, chúng cĩ thể được phân tách, đưa vào và khuấy trộn bằng một hệ thống tự động, sau đĩ cĩ thể được cất trữ hay tạo ra cây con trực tiếp với sự hỗ trợ của các hệ thống máy mĩc.
Sự phát sinh phơi soma trong nuơi cấy lỏng lắc và bioreactor đã được cơng bố ở cây cà rốt, cây carum (họ hoa tán), cây trạng nguyên, cây cỏ linh lăng, cây cần tây,
cây Eschcholtzia californica, cây Octea catharinensis, cây khoai lang, cây cao su và
cây vân sam (spruce).
Tuy nhiên, để đạt được mục đích cuối cùng là tạo hạt nhân tạo thì trong số những giống cây trên, quá trình tạo phơi soma trong nuơi cấy lỏng lắc, bioreactor chỉ mới thành cơng trên một số lồi như ở cây cà rốt, cây cỏ linh lăng, cây cần tây, và cây vân sam trắng và hiện nay đang khảo sát trên một số lồi cây khác (Ziv, 1999). 1.2.5.2. Quá trình phát sinh cơ quan
Hiện nay, hầu hết các thực vật được nhân giống thương mại trên mơi trường bán rắn đều thơng qua con đường phát sinh cơ quan. Đây là một quy trình tốn nhiều thời gian và tiền bạc. Vì vậy nếu chuyển sang tự động hĩa bằng máy sẽ giảm bớt được các thao tác bằng tay và giảm được giá thành lao động.
Một giải pháp đã được sử dụng để tự động hĩa là dùng mơi trường nuơi cấy lỏng trong bioreactor. Thơng tin về việc sử dụng bioreactor cho các cấu trúc đơn tiềm năng như: protocorm, chồi hay đỉnh sinh trưởng bị hạn chế, nguyên nhân chính là do hiện tượng thủy tinh thể ở lá và chồi.
SVTH: Đào Thị Lý -40-
Một trong các nỗ lực đầu tiên về việc sử dụng mơi trường nuơi cấy lỏng để vi nhân giống chồi đã được báo cáo ở cây hoa lan, nĩ được tạo thành từ căn hành với sự kéo dài chồi rất bé trong giai đoạn nuơi cấy lỏng (Morel, 1974). Căn hành cĩ thể được phân tách và cảm ứng tạo cây con mới sau khi đã được nhân giống thơng qua con đường phát sinh cơ quan trong nuối cấy lỏng lắc và trong bioreactor.
Việc kiểm sốt sự tăng trưởng của chồi và cung cấp các điều kiện nuơi cấy thích hợp đã giảm được sự tăng trưởng bất thường của lá và kích thích sự tạo chồi hay các cụm đỉnh sinh trưởng như đã tiến hành ở cây khoai tây và hoa lay-ơn. Chúng cĩ tốc độ kéo dài nhanh và khơng cĩ hiện tượng thủy tinh thể (Ziv, 1999).
1.2.6. Một số vấn đề thường gặp trong nuơi cấy lỏng
Quá trình nhân nhanh trong bioreactor đều sử dụng mơi trường lỏng thay cho mơi trường bán rắn kể từ giai đoạn tái sinh đến giai đoạn tăng sinh khối. Mơi trường nuơi cấy lỏng thường dẫn đến sự phát sinh hình thái bất thường, chẳng hạn như hiện tượng thủy tinh thể (hyperhydricity hay vitrification) (Debergh và cộng sự, 1992).
Cho đến nay, định nghĩa về hiện tượng thủy tinh thể vẫn chưa được rõ ràng. Nĩi chung, đây là một hiện tượng liên quan đến sự rối loạn trong hình thái và sinh lý
của thực vật trong quá trình tăng trưởng in vitro, kết quả làm mất đi khă năng phát
triển bình thường, và sau đĩ kéo theo hàng loạt các vấn đề trong suốt quá trình thích nghi của thực vật khi ra vườn ươm (Paques và Boxus, 1987).
Biểu hiện của thực vật được nuơi cấy trong mơi trường lỏng là thường yếu ớt, xuất hiện các tinh thể nước giống như thủy tinh, mọng nước ở lá và ở chồi, hệ rễ phát triển kém. Lá là cơ quan chịu ảnh hưởng nhiều nhất trong mơi trường lỏng. Chúng phát triển một loại nhu mơ vơ tổ chức, loại này được tạo ra từ các lớp nhu mơ xốp cĩ khơng gian liên bào rộng, một loại mơ mạch khơng định hình, một lớp biểu bì bất thường. Lớp mơ biểu bì của các lá thừa nước thường phát triển khơng tốt và quá trình đĩng mở khí khẩu khơng cịn ổn định như trước.
Hậu quả của hiện tượng thủy tinh thể là lá ít phát triển trong điều kiện in vitro cũng như ex vitro và cĩ thể cả cây cũng vậy, thường yếu và chết. Do vậy, khi hiện
tượng thủy tinh thể xảy ra thì chức năng quang hợp cũng như hơ hấp của lá cĩ thể khơng cịn thực hiện được tốt như trước nữa, nên cây sau khi chuyển ra đất thường ít khả năng sống sĩt và kém phát triển.
SVTH: Đào Thị Lý -41-
Sau khi nhân giống in vitro, các cây xuất hiện hiện tượng bất thường về kiểu hình và cấu trúc giải phẫu, ở giai đoạn ex vitro thường cĩ hiện tượng bất thường về
kiểu hình. Các biểu hiện sai hỏng, chẳng hạn như thừa nước, lá và chồi kém phát triển, phơi bất thường, rối loạn quá trình phát sinh phơi đều là kết quả của sự gián đoạn hay mất tín hiệu trong trình tự của quá trình tái tạo cơ quan ở thực vật. Các vấn đề nêu trên biểu hiện nghiêm trọng hơn đối với nuơi cấy lỏng và cần phải cĩ những nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ cũng như cĩ thể kiểm sốt được sự phát sinh hình thái trong nuơi cấy bioreactor - một mơ hình lớn của nuơi cấy lỏng.
Cĩ nhiều nghiên cứu đã được báo cáo trong việc khắc phục hiện tượng thủy tinh thể và cũng thu được nhiều kết quả. Chẳng hạn như giảm độ ẩm tương đối bằng cách tạo sự trao đổi khí bên trong và bên ngồi của bình nuơi cấy, tăng nồng độ agar trong mơi trường nuơi cấy, sử dụng các chất hấp thụ ethylen như bột than, KMnO4, hoặc alginate STS, sử dụng các loại bình nuơi cấy lớn hơn tạo một sự thống khí cưỡng bức hay bổ sung các chất chống thủy tinh thể (anti-hyperhydricity) cĩ bán trên thị trường, tên thương mại là EM2 (A0807, Sigma-Aldrich, Pool, Dorset, UK), M- Gel (Migros, Immensee, Switzerland), iota-type carrageenan (C1006, batch no 29225, Duchefa Biochemie BV, Haarlem, the Netherlands).
1.2.7. Các thơng số vật lý ảnh hưởng đến mơ thực vật nuơi cấy trong hệ thống bioreactor. bioreactor.
Nguyên tắc của việc thiết kế và vận hành bioreactor là dựa trên nhu cầu sinh học của đối tượng nuơi cấy cũng như những địi hỏi về kỹ thuật, trong đĩ những yếu tố kỹ thuật cần quan tâm gồm: sự vận chuyển khí oxy và khả năng hịa tan oxy vào mơi trường, áp lực tạo ra nhỏ, giảm thiểu những lực va đập và lực xé trong bình nuơi cấy, thuận tiện trong việc điều khiển những thơng số hĩa lý và cuối cùng là cĩ tính khả thi khi mở rộng sang trong quy mơ sản xuất lớn.
1.2.7.1. Khơng khí
Khơng khí trong bình nuơi cấy cĩ thành phần gồm nitrogen (78%), oxy (21%) và carbon dioxide (0.036%). Lượng khơng khí trong bình nuơi cấy được quyết định bởi hai yếu tố: thể tích của bình và độ thống khí.
SVTH: Đào Thị Lý -42-
Thực vật thải CO2 và tiêu thụ O2 trong quá trình hơ hấp, cịn trong quang hợp thì thực vật tiêu thụ CO2 và thải ra khí O2. Trong pha tối, nồng độ CO2 tăng lên trong nuơi cấy, cịn khi điều kiện quang tự dưỡng chiếm ưu thế thì nồng độ đĩ giảm đi
trong pha sáng. Trong quá trình nuơi cấy, thực vật in vitro cịn thải thêm nhiều loại
khí thải như ethylene, ethanol, acetaldehyde và hydrocarbon vào bầu khơng khí trong bình nuơi cấy.
Hầu hết ảnh hưởng của CO2, O2 và C2H4 đối với sự tăng trưởng của thực vật in
vitro chỉ được nghiên cứu trong điều kiện nuơi cấy bán rắn hay nuơi cấy huyền phù
tế bào. Đối với các bioreactor, pha khí phụ thuộc vào dịng khơng khí đi vào và do đĩ cĩ thể dễ dàng được kiểm sốt để cung cấp đúng lượng CO2, O2 và C2H4 cần thiết.
Đối với loại bioreactor air-lift và bioreactor sục khí hình trụ, khí được cung cấp vào hệ thống theo hai hình thức là khuấy trộn và sục khí. Tầm quan trọng của pha khí và việc sục khí đã được tìm hiểu khi nuơi cấy khoai tây bằng bioreactor air-lift. Trong điều kiện nuơi cấy chìm liên tục, quá trình tạo củ bị ức chế. Các củ bi chỉ phát triển sau khi các chồi được kéo dài ra và được tiếp xúc pha khí ở phần trên bioreactor.
Các biện tăng cường thêm lượng O2, điều khiển lượng hormone và các điều kiện thẩm thấu đều khơng cĩ hiệu quả và đều khơng giải thích được cho hiện tượng trên. Nhưng nếu thay bằng hình thức nuơi cấy 2 pha, mơi trường cĩ bổ sung 9% sucrose để cảm ứng tạo củ thì sự tạo củ từ chồi sẽ phát triển, vượt lên cả mơi trường, tiếp xúc với pha khí ở phía trên. Các kết quả đĩ đã cho thấy tầm quan trọng của pha khí trong bioreactor đối với sự phát triển đặc biệt của thực vật.
1.2.7.2. Oxy hịa tan
Một trong những chức năng của bioreactor là khả năng tăng cường khả năng vận chuyển oxy từ pha khí sang pha lỏng. Do oxy chỉ hịa tan một phần trong nước (0.25 mmol.l-1 ở 25oC, 1 atm, oxy chiếm 21% thể tích khơng khí) nên để đáp ứng nhu cầu oxy cho sự phát triển của mơ thực vật, một lượng lớn oxy cần được khếch tán vào mơi trường nuơi cấy (Leathers và cộng sự, 1995). Những yếu tố liên quan đến vấn đề này gồm cĩ độ thống khí, tốc độ khuấy đảo, hình dạng cánh khuấy, độ hịa trộn khơng khí và kết cấu của bioreactor. Ngồi ra, mức độ đảo trộn của mẫu cấy
SVTH: Đào Thị Lý -43-
cũng là yếu tố cần quan tâm do oxy hịa tan trong mơi trường cần nhanh chĩng được mơ và tế bào hấp thu.
Tĩm lại, để đáp ứng tốt nhất nhu cầu oxy cho sự phát triển của mơ và tế bào thực vật, lượng oxy hịa tan trong dung dịch nuơi cấy luơn phải lớn hơn ngưỡng oxy hịa tan cực đại mà tế bào mơ hấp thu (DO2 htcđ). Trong tình huống lượng oxy hịa tan trong mơi trường nhỏ hơn DO2 htcđ, năng lượng ATP của tế bào giảm sút, từ đĩ ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát sinh hình thái và sự trao đổi chất của tế bào (Leathers và cộng sự, 1995).
Trong thực tế, người ta căn cứ vào giá trị DO2 htcđ để thiết kế bioreactor và giá trị này cũng là yếu tố cần được quan tâm hàng đầu khi tiến hành phĩng đại hệ thống lên quy mơ lớn hơn.
1.2.7.3. Sự đảo trộn
Thơng số về sự đảo trộn là một yếu tố quan trọng khác vì nĩ phản ánh mức độ đồng đều trong phân phối chất dinh dưỡng và mẫu cấy trong tồn bộ khơng gian nuơi cấy (Leathers và cộng sự, 1995). Việc đảo trộn được thực hiện dưới những hình thức như sục khí, khuấy trộn cơ học hoặc kết hợp cả hai hình thức trên.
Tuy nhiên, cần lưu ý rằng thủy động lực của các quá trình khuấy trộn chỉ được ở mức vừa đủ để kích thích mơ, thực vật chứ khơng được quá lớn đến mức làm tổn thương mơ, tế bào nuơi cấy.
Cho đến nay, việc nghiên cứu một cách chi tiết ảnh hưởng của thủy động lực lên cấu trúc, thành phần mơ, tế bào vẫn cịn nhiều hạn chế. Những nghiên cứu đã cơng bố chủ yếu chỉ đề cập đến động lực của sự tăng trưởng tế bào và sự hình thành các sản phẩm thứ cấp.
1.2.7.4. pH
Theo một số tác giả, sự thay đổi độ pH của mơi trường trong quá trình nuơi cấy liên quan đến sự cân bằng các muối ammonium trong mơi trường (Escalona và cộng sự, 1999). Khi pH hạ xuống dưới 5.0, mơ thực vật sẽ bị ức chế một cách rõ rệt. 1.2.7.5. Chất dinh dưỡng
Trong nuơi quy mơ lớn, thành phần dinh dưỡng là yếu tố hĩa học quan trọng. Những kết quả thu nhận định kỳ trong suốt quá trình nuơi cấy cung cấp thơng tin về
SVTH: Đào Thị Lý -44-
sự hấp thu chất dinh dưỡng, lượng sinh khối được tạo thành và những sản phẩm bậc hai được sản xuất trong hệ thống bioreactor.
Chẳng hạn như dựa trên những phân tích chi tiết về thành phần dinh dưỡng khi
nuơi cấy củ Lilium trong hệ thống bioreactor sục khí dạng hình cầu, tác giả nhận thấy
rằng sau 16 tuần nuơi cấy, các muối ammonium, nitrate, phosphate hầu như cạn kiệt, trong khi các ion K+, Mg2+, Ca2+, Na+ và Cl- vẫn cịn một lượng trong mơi trường. Điều đặc biệt là lúc này, surose trở thành một yếu tố gây ức chế sự tăng trưởng thay vì là một nguồn dinh dưỡng chính.
Những thí nghiệm tương tự cũng được tiến hành trên nhiều đối tượng khác như
Begonia, huyền phù tế bào lúa, phơi soma cây cà rốt, rễ bất định nhân sâm và củ
khoai tây bi được nuơi cấy trong bioreactor.
Tuy nhiên, vẫn cịn cĩ những nghiên cứu chi tiết hơn về sự tương tác giữa các chất điều hịa và chức năng của những hợp chất dinh dưỡng khi nuơi cấy trong hệ thống bioreactor. Những kết quả phân tích này sẽ mở ra khả năng điều khiển tốt hơn những quá trình phát sinh phơi và phát sinh cơ quan của thực vật.
Qua nhiều nghiên cứu khác nhau về sử dụng bioreactor trong nuơi cấy thực vật, người ta kết luận rằng khơng cĩ một mơ hình nào thích hợp cho tất cả các đối tượng, mà các giải pháp sẽ được lựa chọn dựa trên các loại mơ, đối tượng thực vật nuơi cấy cũng như quy mơ và tính kinh tế của việc sản xuất.
Tĩm lại, sử dụng bioreactor trong nuơi cấy mơ là một phương pháp đầy triển vọng trong nhân số lượng lớn tế bào, phơi và cơ quan thực vật (chồi, thân hành, củ, giả hành,…). Đã cĩ nhiều nghiên cứu về ứng dụng của bioreactor trong nhân giống lớn các cây cảnh, cây dược liệu được cơng bố. Tuy nhiên, người ta cũng khuyến cáo rằng rất khĩ để cĩ một hệ thống bioreactor tối ưu cho tất cả các loại đối tượng và mục đích nuơi cấy do những đặc tính khác biệt giữa các lồi thực vật.
Mặc dù vậy, ưu điểm vượt trộn của bioreactor là một khi đã xác định được điều kiện nuơi cấy tối ưu cho hệ thống nhỏ, ta hồn tồn cĩ thể áp dụng trong nhân giống ở quy mơ lớn hơn (từ 500 – 1000 lít).
SVTH: Đào Thị Lý -45-
Mơi trường lỏng là mơi trường đã được sử dụng trong nuơi cấy tế bào, phơi soma hay cơ quan thực vật kể cả trong nuơi cấy tĩnh hay các kiểu bioreactor khác nhau.
Mặc dù trước đây bioreactor chủ yếu được sử dụng trực tiếp cho nuơi cấy huyền phù tế bào và sản xuất sản phẩm thứ cấp, nhưng gần đây cũng cĩ nhiều bioreactor được cải tiến để tạo phơi soma mà đã được cơng bố trên một số giống cây