5. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Chồi nuơi cấy: gồm các chồi in vitro của hai giống lan Hồ điệp (Phalaenopsis
Yubidan) và lan Dendrobium Sonia 12 tuần tuổi của phịng Cơng nghệ Sinh học -
Viện khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp Miền Nam, được tạo từ các PLB năm 2008. Mơi trường nuơi cấy: Các thí nghiệm sử dụng mơi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) lỏng, với khống đa lượng (NH4NO3, KNO3, Mg2SO4, CaCl2, KH2PO4) được điều chỉnh theo tỉ lệ 0, ¼, ½ và 1. Các muối trung, vi lượng (MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, CuSO4.5H2O, KI, CoCl2.6H2O, H3BO3, Na2MoO4.2H2O, Na2.EDTA, FeSO4.7H2O) và các muối hữu cơ và các vitamin (Myo-Inositol, Nicotinic acid, Pyridoxine HCl, Thiamine HCl, Glycine) vẫn giữ nguyên hàm lượng như mơi trường MS cơ bản. Các chất bổ sung vào mơi trường mơi trường nuơi cấy gồm: NAA, BA và Tryptone, đường, Polyvinylpyrolidone (PVP).
SVTH: Đào Thị Lý -70-
Hệ thống nuơi ngập tạm thời TIS (Temporary Immersion System): Hệ thống TIS do hãng RITA của Pháp thiết kế và sản xuất. Hệ thống TIS gồm: 20 RITA- bioreactor, 1 bơm nén khí, 1 lược phân phối khí, 42 van lọc khuẩn (0.2-0.45µm) và 1 Timer điều khiển chu kỳ hoạt động tồn bộ hệ thống.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: đề tài thực hiện từ 04/02/2009 – 14/05/2009
Địa điểm: đề tài thực hiện tại phịng thí nghiệm Mơ - Tế bào Thực vật, thuộc phịng Cơng nghệ Sinh học, Viện Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp miền Nam.
Các dụng sử dụng trong phịng nuơi cấy mơ
Dụng cụ pha mơi trường và khử trùng dụng cụ nuơi cấy
Cân phân tích cĩ tải cân từ 0.0001g đến 250g.
Máy đo pH để hiệu chỉnh pH mơi trường trước khi hấp khử trùng. Pippetmen cĩ dung tích từ 10 – 1000 µl và từ 1 - 10 ml.
Ống đong cĩ dung tích 1000 ml và cốc thủy tinh từ 50 – 3000 ml. Bình định mức 25 ml, 50 ml.
Đũa khuấy thủy tinh, máy khuấy từ. Máy cất nước 1 lần 8 lít/giờ.
Nồi hấp khử trùng (autoclave) dung tích 85 lít và 40 lít. Tủ mát 40C dùng bảo quản hố chất và dung dịch mẹ. Tủ UV khử trùng bề mặt.
Dụng cụ trong phịng cấy
Tủ cấy đơi, kiểu giĩ thổi ngang, kích thước lỗ màng lọc 0.2 - 0.3 µm. Dụng cụ giải phẫu mơ gồm: dao, kéo, kẹp, đèn cồn, giá để dụng giải phẫu. Khay đựng mẫu cấy, giấy lĩt khử trùng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Cách pha mơi trường 2.2.1. Cách pha mơi trường
SVTH: Đào Thị Lý -71-
Bước 1: Hút 20ml dung dịch mẹ các khống đa lượng, khống vi lượng và
10ml nhĩm vitamin. Cân các chất: đường, tryptone và hút BA, NAA. Khuấy đều và hịa tan hồn tồn các chất trong nước cất theo thể tích đã định sẵn.
Bước 2: Định mức và đo pH 5.8 (điều chỉnh pH bằng NaOH 1N hay HCl 1N) Bước 3: Phân phối 150 ml mơi trường cho mỗi bioreactor.
Bước 4: Đậy nắp, gắn van lọc khuẩn vào bioreactor và hấp khử trùng mơi
trường ở 121oC với áp suất 1 atm, trong 20 phút.
b. Pha dung dịch mẹ
Thành phần mơi trường khống MS (Murashige và Skoog, 1962) Tên nhĩm Nhĩm Thành phần hố chất Khối lượng hĩa chất (mg/l) Dung dịch mẹ x 50 (mg/l) Lượng dùng (ml) 1 NH4NO3 KNO3 1650 1900 82,5 95 2 Mg2SO4.7H2O 370 18,5 3 CaCl2.2H2O 440 22 Khống đa lượng 4 KH2PO4 170 8,5 20 2 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O 22,3 8,6 0,025 1,115 0,43 0,00125 3 KI CoCl2.6H2O 0,83 0,025 0,042 0,00125 4 H3BO3 Na2MoO4.2H2O 6,2 0,025 0,32 0,013 Khống vi lượng 5 Na2.EDTA FeSO4.7H2O 37,3 27,8 7,46 5,56 20 x 100 (g/l) Myo-Inositol 100 10 Nicotinic acid 0,5 0,05 Pyridoxine HCl 0,5 0,05 Vitamin và chất hữu cơ 6 Thiamine HCl 0,1 0,01 10
SVTH: Đào Thị Lý -72-
Glycine 2,0 0,20
Các chất điều hịa sinh trưởng: cân 0.1g BA pha và hịa tan trong 1 ít NaOH 1N rồi định mức100ml bằng nước cất vơ trùng, lượng dùng là hút 1ml tương ứng cho 1mg BA. Tương tự cho chất NAA.
2.2.2. Các thao tác trong phịng cấy
Rửa sạch tay bằng xà bơng trước khi thao tác, mặc áo blouse, nĩn, khẩu trang và mang găng tay.
Khử trùng tủ cấy trước khi thao tác cấy mẫu: lau kỹ tủ cấy bằng cồn 70o; bật đèn UV thời gian 15 phút, tặt đèn UV và khởi động tủ cấy.
Các thao tác trong tủ cấy:
- Lau cồn 70o các bioreactor đựng mơi trường, chai mẫu và các vật dụng bằng trước khi đưa vào tủ cấy.
- Đốt các dụng cụ giải phẫu bằng cồn 96o sau mỗi lần thay đổi thao tác và gác lên kệ để nguội mới tiến hành tách hoặc cấy chồi.
- Các mẫu cấy bị rơi trên mặt bàn khơng được sử dụng cấy lại.
- Hơ kỹ miệng và nắp hộp bioreactor trước và sau khi cấy mẫu, thao tác cấy mẫu phải nhanh nhẹ.
- Khi cấy hạn chế vơ tay qua mẫu nhằm hạn chế nhiễm nấm; - Tránh để tay mới lau cồn gần đèn cồn khi đang cháy.
- Vệ sinh sạch sẽ tủ cấy bằng cồn 70o sau khi kết thúc cơng việc. 2.2.3. Cách bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên, gồm 6 nghiệm thức mơi trường, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, thực hiện trên hai giống lan Hồ điệp
SVTH: Đào Thị Lý -73-
Cơng thức mơi trường thí nghiệm: gồm 6 cơng thức Ký
hiệu
Sự thay đổi nồng độ khống đa lượng trong mơi trường nuơi cấy MS (Murashige & Skoog, 1962)
Các chất bổ sung
S1 ½ KĐL trong suốt 8 tuần nuơi cấy S2 ¼ KĐL trong suốt 8 tuần nuơi cấy
S3 ¼ KĐL trong 4 tuần đầu và ½ KĐL cho 4 tuần sau S4 ¼ KĐL trong 2 tuần đầu, ½ KĐL từ tuần thứ 4 đến
tuần thứ 6 và 1 KĐL cho tuần thứ 8 S5
1
KĐL (giữ nguyên hàm lượng các KĐL trong suốt 8 tuần nuơi cấy)
S6
0
KĐL trong 2 tuần đầu, ¼ KĐL tuần thứ 4, ½ KĐL tuần thứ 6 và 1 KĐL tuần thứ 8 1mg/ml BA 0,5mg/l NAA 500mg/l PVP 1000mg/l tryptone 30000mg/l sucrose
Ghi chú: KĐL = khống đa lượng: NH4NO3, KNO3, Mg2SO4.7H2O, CaCl2.2H2O và KH2PO4.
Sự thay đổi nồng khống đa lượng trong mơi trường nuơi cấy MS sử dụng
trong thí nghiệm nhân chồi lan Phalaenopsis Yubidan và lan Dendrobium Sonia,
thực hiện trong hệ thống TIS như:
Nồng độ khống đa lượng trong mơi trường MS Ký hiệu mơi
trường 2 tuần 4 tuần 6 tuần 8 tuần
S1 ½ ½ ½ ½ S2 ¼ ¼ ¼ ¼ S3 ¼ ¼ ½ ½ S4 ¼ ½ ½ 1 S5 1 1 1 1 S6 0 ¼ ½ 1
SVTH: Đào Thị Lý -74-
Chọn chồi phát triển bình thường, cĩ 3 lá, lá màu xanh đậm; Cân khối lượng tươi 25 chồi ban đầu trước khi vơ mẫu;
Thể tích mơi trường lỏng sử dụng trong mỗi hộp bioreactor là 150 ml; Chu kỳ ngập mơi trường 4 giờ/lần, thời gian ngập 4 phút;
Chu kỳ nhân chồi là 8 tuần;
Chu kỳ thay mơi trường 2 tuần/lần;
Điều kiện phịng nuơi: ánh sáng đèn huỳnh quang, cường độ ánh sáng 1800 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ phịng nuơi 25oC (± 2oC), ẩm độ phịng 30%.
Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, hấp 20 phút đối với mơi trường nuơi và 30 phút đối với dụng cụ.
Sử dụng van lọc khuẩn 0.2 µm và 0.45 µm. 2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khống đa lượng đến sự hình thành và phát
triển của chồi lan Phalaenopsis Yubidan.
2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khống đa lượng đến sự hình thành và phát
triển của chồi lan Denrobium Sonia.
2.4. Các chỉ tiêu theo dõi.
Các thí nghiệm theo dõi 2 tuần/lần đồng thời với chu kỳ thay mơi trường nuơi cấy: 1. Xác định tỉ lệ chồi sống qua các chu kỳ nuơi: đếm số chồi sống và số chồi
chết/ bioreactor sau 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần nuơi cấy.
2. Xác định số chồi mới hình thành: đếm số chồi mới hình thành/ bioreactor sau 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần nuơi cấy.
3. Xác định khối lượng chồi tươi của các nghiệm thức: cân tất cả các chồi cịn sống/ bioreactor sau 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần nuơi cấy.
4. Theo dõi và ghi nhận khả năng tái tạo và phát triển của chồi ở các nghiệm thức thí nghiệm
- Quan sát sự thay đổi màu sắc, kích thước chồi, lá so với ban đầu và với các nghiệm thức khác sau các chu kỳ thay mơi mơi trường;
- Quan sát số lá/ chồi mới hình thành sau 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần nuơi cấy;
SVTH: Đào Thị Lý -75-
- Sự xuất hiện các biến dị ở các nghiệm thức. 2.5. Phân tích thống kê.
Các kết quả thí nghiệm xử lý thống kê theo phương pháp phân tính phương sai theo bảng Anova. So sánh kết quả và xếp hạng theo phương pháp Duncan. Sử dụng phần mềm xử lý thống kế MSTATC và Microsoft Excel.
CHƯƠNG 3:
KẾT QUẢ – THẢO LUẬN
3.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khống đa lượng đến sự hình
thành và phát triển của chồi lan Phalaenopsis Yubidan.
Trong nuơi cấy mơ vi nhân giống cây trồng, chồi là cung đoạn rất quan trọng trong qui trình sản xuất cây giống. Hệ số nhân chồi và chất lượng chồi cĩ ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng và chất lượng cây giống và cuối cùng là chất lượng thương mại của sản phẩm hoa. Đối với lan Hồ điệp, thuộc lồi thân đơn, hệ số nhân chồi
SVTH: Đào Thị Lý -76-
trong mơi trường thạch truyền thống thường thấp. Sự tái sinh chồi cũng như chất lượng của chồi phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong mơi trường nuơi cấy. Đặc biệt là các yếu tố đa lượng như N, P, K và chất điều hồ sinh trưởng như auxin hay cytokinine tuy nhiên sử dụng chất điều hồ sinh trưởng cĩ thể gây biến dị chồi, ảnh hưởng đến chất lượng cây giống và hoa sản phẩm. TIS là một kỹ thuật cơng nghệ mới, sử dụng mơi trường lỏng để nhân chồi lan, rất ít tài liệu nghiên cứu trong lĩnh vực này, đặc biệt là nồng độ các khống đa lượng trong mơi trường nhân chồi.
Đề tài tiến hành thí nghiệm với các nồng độ khống đa lượng thay đổi khác nhau trong mơi trường nuơi cấy MS lỏng. Nồng độ khống đa lượng thay đổi từ 0, ¼,
½ và 1 đối với giống lan Hồ điệp (Phalaenopsis Yubidan) trong hệ thống nuơi cấy
ngập tạm thời TIS. Kết quả thực hiện thí nghiệm trên bảng 3.1.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng các nồng độ khống đa lượng đến khả năng hình thành chồi
lan Phalaenopsis Yubidan.
Số chồi lan hình thành qua các giai đoạn Stt Kí hiệu mơi
trường 2 tuần 4 tuần 6 tuần 8 tuần
1 S1 41a 74ab 110b 150b 2 S2 38ab 47c 83c 99c 3 S3 34c 47c 83c 114c 4 S4 37bc 84a 150a 200a 5 S5 36bc 60bc 64c 87c 6 S6 30d 56c 73c 91c Cv(%) 6.18 15.02 12.71 15.71 LSD(0.05) 3.934 16.14 21.08 35.02
SVTH: Đào Thị Lý -77-
Ghi chú: Những chữ giống nhau trên cùng một cột, giá trị khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống
kê với P = 0.05 trong Duncan’s test.
Số chồi mẫu ban đầu là 25 chồi/bioreactor
Trên bảng 3.1 cho thấy ngay từ 2 tuần đầu nuơi cấy, số chồi mới gần như khơng hình thành trên mơi trường khơng cĩ khống đa lượng. Cụ thể mơi trường S6 số chồi hình thành rất thấp chỉ xuất hiện 5 chồi. Tuy nhiên số chồi gia tăng này khơng phân bố đồng đều trên các chồi mẫu mà chỉ xuất hiện cục bộ trên một vài chồi. Điều này cĩ thể một số chồi mẫu ban đầu đã cĩ mầm mống của chồi nách trước khi đưa vào nuơi cấy. Như vậy, chứng tỏ các khống đa lượng đĩng vai trị rất quan trọng trong quá trình hình thành chồi lan. Điều này cũng thể hiện rất rõ giai đoạn 4 tuần nuơi cấy, ở các cơng thức S2, S3 và S6 cĩ nồng độ khống đa lượng thấp (¼ KĐL), số chồi mới hình thành rất thấp so với các cơng thức khác cĩ nồng độ khống đa lượng cao hơn, đặc biệt là ½ KĐL như mơi trường S1 và S4.
Sự gia tăng chồi mới ở giai đoạn 6 tuần và 8 tuần nuơi cấy vẫn tiếp tục tăng cao rất cĩ ý nghĩa ở mơi trường S1 và S4. Điều đáng lưu ý ở đây là mơi trường S5, nồng độ các khống đa lượng khơng thay đổi so với mơi trường MS cơ bản (1 KĐL) trong suốt thời gian 8 tuần nuơi cấy lại cĩ số chồi hình thành thấp nhất. Trong khi mơi trường S1 cũng duy trì một nồng độ khống đa lượng trong suốt thời gian nuơi cấy (nồng độ khống đa lượng ½) lại cho số chồi cao. Điều này chứng tỏ nếu giảm ½ khống đa lượng trong mơi trường nuơi cấy MS cơ bản sẽ làm tăng khả năng tạo chồi lan Hồ điệp. Kết quả này cũng trùng hợp với nghiên cứu của Hempfling Tino và Preil Walter (2005), Yeh D. M. và cộng sự (2007), và Cung Hồng Phi Phượng (2007) sử dụng mơi trường MS lỏng ½ khống đa lượng trong nhân chồi lan Hồ điệp.
Nếu thay đổi nồng độ khống đa lượng trong mơi trường MS theo hướng tăng dần ở mức ¼ tại các giai đoạn nuơi cấy 2, 4, 6, và 8 tuần như mơi trường S4 (¼ KĐL trong 2 tuần đầu, ½ KĐL từ tuần thứ 4 đến tuần thứ 6 và 1 KĐL cho tuần thứ 8) thì khả năng tạo chồi là cao nhất. Điều này cĩ thể nhận xét rằng sự thay đổi nồng độ khống đa lượng ở các chu kỳ nhân chồi sẽ gĩp phần kích hoạt sự hình thành chồi của lan Hồ điệp trong hệ thống TIS.
SVTH: Đào Thị Lý -79- S 1 S 2 S 3 S 4 S 5 S 6
Hình 3.1: Sự hình thành và phát triển của chồi lan Phalaenopsis Yubidan sau
SVTH: Đào Thị Lý -80-
Đối với cây trồng, khống đa lượng khơng những tham gia vào quá trình hình thành nên chồi mà cịn tham gia vào sự tăng trưởng (tăng trọng) của chồi. Tuỳ thuộc vào thành phần và nồng độ khống khác nhau trong mơi trường dinh dưỡng mà sự ảnh hưởng đến sự tăng trọng của chồi khác nhau.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng các nồng độ khống đa lượng đến sự tăng trọng chồi lan
Phalaenopsis Yubidan.
Khối lượng chồi (g) Stt
Kí hiệu mơi
trường 2 tuần 4 tuần 6 tuần 8 tuần
Đặc tính tăng trưởng của chồi
1 S1 4.56bc 8.16ab 14.95ab 23.88a Chồi lớn, cĩ 3 lá, xanh đậm
2 S2 4.30bc 5.87c 8.07c 12.09c
Chồi lớn, khơng đều, cĩ 1-3 lá màu xanh tím, xuất hiện nhiều rễ và dài.
3 S3 3.98c 6.03bc 9.50c 17.47bc Chồi nhỏ, khơng đều, cĩ 1-3 lá, màu xanh, tím, cĩ rễ. 4 S4 6.02a 8.71a 16.14a 22.50ab Chồi nhỏ, đều, cĩ 2-3 lá, lá
xanh đậm
5 S5 5.16ab 8.10ab 11.70bc 16.08c Chồi lớn, cĩ 3-5 lá, lá to, lá bị xoăn, xanh đậm, cĩ rễ lớn. 6 S6 3.90c 5.10c 8.38c 13.43c Chồi nhỏ, khơng đều, màu
xanh đậm, cĩ rễ.
Cv(%) 13.95 16.86 18.21 18.20 LSD(0.05) 1.125 2.091 3.727 5.885
Ghi chú: Những chữ giống nhau trên cùng một cột, giá trị khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê với P = 0.05
Kết quả bảng 3.2 cho thấy, sau 4 tuần nuơi cấy chồi lan Phalaenopsis Yubidan
với nồng độ khống đa lượng cao (½ KĐL hay 1 KĐL) thì chồi đạt trọng lượng tươi cao. Cụ thể mơi trường S1, S4 và S5. Nhưng qua 4 tuần nuơi cấy tiếp theo, mơi
SVTH: Đào Thị Lý -81-
trường S5 (với 1 KĐL trong suốt 8 tuần nuơi cấy) cĩ khối lượng chồi tươi thấp nhất. Chồi phát triển khơng đều, lá bị xoăn lại và cĩ màu xanh đậm, xuất hiện rễ to và dài.
Cĩ thể nĩi khống đa lượng khơng những ảnh hưởng đến sản lượng chồi lan Hồ điệp mà cịn đến trọng lượng tươi của chồi. Với các nồng độ khống đa lượng khác nhau sẽ ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển chồi khác nhau.
Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự hình thành và phát triển chồi lan hồ điệp
23.9 12.1 17.5 22.5 16.1 13.4 0 50 100 150 200 250 S1 S2 S3 S4 S5 S6 Môi trường số chồi khối l ượng chồi (g)
Biểu đồ 3.1 cho thấy mơi trường S1 và mơi trường S4 khơng chỉ cho số chồi cao nhất mà khối lượng chồi lan Hồ điệp ở hai mơi trường này cũng đạt ở mức cao điều này phần nào phản ánh được chất lượng chồi của hai mơi trường này. Tuy nhiên