Tế bào MCF7 sau khi chuyển nhiễm siRNA và được chứng minh là gene ST3Gal-I đã bị knock-down, được chúng tôi thu nhận để chuẩn bị cho việc tách chiết glycoprotein trên màng tế bào. Việc tách chiết glycoprotein trên màng tế bào là để phục vụ cho thí nghiệm điện di, nhuộm bạc và phân tích khối phổ sau này. Quá trình tách chiết glycoprotein trên màng tế bào cần phải thực hiện một cách chính xác để đảm bảo lượng glycoprotein thu được là lớn và tinh sạch. Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng đệm EDTA và RIPA cho thí nghiệm này theo phương pháp truyền thống của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới.
Sau khi ly giải tế bào và thu glycoprotein trong dịch ly giải, hàm lượng protein này được xác định bằng bộ Pierce BCA Protein Assay Kit của Thermo Scientific. Kết quả cụ thể được trình bày ở hình 4.6 và bảng 4.4.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 4.4. Hàm lượng Glycoprotein thu được từ tế bào chuyển nhiễm siRNA Mẫu thí nghiệm OD Hàm lƣợng (mg/ml) Mẫu chuẩn BSA OD Hàm lƣợng BSA (mg/ml) H2O 0.060 0.000 BSA 0.125 0.269 0.125 RIPA 0.076 0.000 BSA 0.25 0.423 0.250 Control 4X 0.996 3.262 BSA 0.5 0.673 0.500 ST3Gal-I 4X 1.127 3.773 BSA 1.0 1.163 1.000 y = 1.0101x + 0.1587 R2 = 0.9989 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Series1 Linear (Series1)
Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn về tương quan nồng độ BSA và giá trị OD thu được
Đường chuẩn về tương quan nồng độ BSA và giá trị OD thu được được thiết lập nhờ phần mềm EXCEL. Như vậy, mối tương quan giữa hàm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lượng BSA và giá trị OD được hiển thị bằng đường y = 1,0101x + 0,1587 với hệ số tương quan r2
= 0,9989, đã thể hiện mối tương quan rất chặt và tin cậy của số liệu thu được.
Dựa vào giá trị mật độ quang OD có được của mẫu kiểm tra (giá trị Y) và theo phương trình tính toán ở trên nhờ vào mẫu chuẩn BSA, ta có được hàm lượng glycoprotein của tế bào chuyển nhiễm scramble RNA là 3,262 mg/ml (đối chứng) và của tế bào chuyển nhiễm siRNA là 3,377 mg/ml.
Như vậy, hàm lượng glycoprotein thu được là tương đối lớn và đủ để thực hiện thí nghiệm điện di, nhuộm bạc phục vụ cho phân tích khối phổ. Theo đó, các mẫu protein này được điều chỉnh để có hàm lượng là 1mg/ml và được cho vào các ống nhỏ cất giữ lâu dài trong -80oC để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.