2. đa dạng di truyền
3.2.2. Phương pháp: Áp dụng chỉ thị SSR và RAPD ựể ựánh giá sự ựa dạng của các mẫu giống khoai môn Ờ sọ.
của các mẫu giống khoai môn Ờ sọ.
3.2.2.1. Quy trình tách chiết DNA
- Bước 1: Thu mẫu lá non cây khoai môn - sọ khỏe, cắt lá cho vào túi nilong, dánh dấu tên giống rồi bỏ vào ựá lạnh.
- Bước 2: trong phòng thắ nghiệm các cối sứ ựã ựược khử trùng ựặt trên ựá lạnh, cắt 1g lá non cắt vào cối sứ.
- Bước 3: Cho 800ộl dung dịch chiết tách DNA vào cối sứ rồi lấy chày nghiền nhỏ mẫu lá, chuyển dung dịch vào ống effpendoff vô trùng ựã ựánh dấu cùng giống mang ủ 650C trong 30 phút.
- Bước 4: Giữ mẫu ở nhiệt ựộ phòng 5 phút sau ựó cho thêm 800ộl hỗn hợp choloroform : isoamylalcol ( 24 : 1 ) vào ống, lắc nhẹ 10 phút sau ựó mang ly tâm 13000 vòng/ phút trong 15 phút rồi chuyển phần dịch phắa trên sang ống effpendoff vô trùng ựã ựánh dấu cùng giống.
- Bước 5: Cho 800ộl hỗn hợp ( 24 : 1 ) vào ống, lắc nhẹ 10 phút rồi mang ựi ly tâm 13000 vòng/ phút trong 15 phút, chuyển phần dịch phắa trên sang ống effpendof vô trùng ựã ựánh dấu cùng giống.
- Bước 6: Thêm 800ộl isopropanol lắc ựều ựem ủ 30 phút ở - 200C.
- Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 15 phút, ựổ dịch lỏng thu kết tủạ
- Bước 8: Rửa kết tủa bằng ethanol 70% ựể khô tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33 Sau khi tách chiết DNA, chạy ựiện di trên gel agarose 1% ựể kiểm tra sản phẩm DNA của mẫu ựã tách chiết. Sau khi chạy ựiện di xong, nhuộm sản phẩm DNA trong gel agarose bằng Ethilium bromide nồng ựộ 10mg/ml trong 15 phút. Quan sát và phân tắch các vệt băng bằng ựèn UV. Kết quả mẫu có DNA tinh sạch khi có vệt băng sáng rõ nét, ngược lại mẫu không có DNA khi không thấy xuất hiện vệt băng.
3.2.2.2. Thành phần dung dịch ựệm chiết tách DNA và dung dịch ựệm TE
Bảng 3.2. Thành phần dung dịch ựệm chiết tách DNA Hóa chất Nồng ựộ dung dịch mẹ Nồng ựộ dung dịch làm việc Hỗn hợp 10ml dung dịch chiết tách NaCl 5M 1,5M 3,03 ml EDTA 0,5M 50mM 1 ml Tris - HCl 1M 100mM 1 ml CTAB 4% 0,4g βmercaptoethanol 0,5% 0,05 ml Nước cất 4,92 ml Bảng 3.3.Thành phần dung dich dệm TE Hóa chất Nông ựộdung
dịch mẹ Nồng ựộ dung dịch làm việc Hỗn hợp 50ml dung dịch chiết tách Tris Ờ HCl ( pH = 8 ) 1M 50 mM 0.5 ml EDTA 0,5M 1 mM 0.1 ml Nước cất 49,4 ml
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
3.2.2.3. Chỉ thị RAPD và SSR
RAPD dựa trên phản ứng PCR: Sử dụng các cặp mồi ựơn ( từ 6 Ờ 10 Nucleotid ) có trình tự thiết kế một cách ngẫu nhiên. Chỉ thị SSR là những ựoạn DNA ựược lặp lại một cách có trật tự, gồm những ựơn vị lặp lại gồm từ 1 ựến 6 nucleotidẹ Bản chất ựa hình của SSR có thể ựược sinh ra do sự nhân bội của DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 ựoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai ựầu của vùng lặp lạị Trình tự các mồi trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Các chỉ thị sử dụng nghiên cứu ựa dạng
Chỉ thị RAPD
Trình tự Chỉ thị SSR
Trình tự
OPM-12 5Ỗ- ggg acg ttg g-3Ỗ Uq 75-100 f: 5Ỗ-ttg gtc aga tca agg ctag ag-3Ỗ r: 5Ỗ-gac taa cat cac aca cac acg-3Ỗ OPA-12 5Ỗ- tcg gcg ata g-3Ỗ uq95-219 f: 5Ỗ- aca act cgt gta tcc tac atc c -3Ỗ
r: 5Ỗ-tca act ctc aaa ccc ttc cc -3Ỗ OPN 07 5Ỗ-cag ccc aga g-3Ỗ uq77-174 f: 5Ỗ- gat ctc aag cac aag aga cg-3Ỗ OPN 07 5Ỗ-cag ccc aga g-3Ỗ uq77-174 f: 5Ỗ- gat ctc aag cac aag aga cg-3Ỗ
r: 5Ỗ- tca acc ttc tcc atc agt cc-3Ỗ OPN 14 5Ỗ-ctg ttg cta c-3Ỗ uq82-117 f: 5Ỗ- tca agc gta ggg gaa aaa c-3Ỗ
r:5Ỗ- cca caa cac aaa act gta aac c-3Ỗ OPO 01 5Ỗ-ggc acg taa g-3Ỗ uq90-102 f: 5Ỗ-tgg tgc gtt ggt cag atc aag g-3Ỗ