2. đa dạng di truyền
2.7.3. Phân loại bằng chỉ thị phân tử DN
Chỉ thị DNA ựược sử dụng ựể phân biệt sự khác nhau về kiểu hình giữa các cá thể dòng giống và các loài khác nhaụ Sự ựa dạng dựa trên cơ sở sự biến ựổi ở mức phân tử là công cụ ựể ựánh giá sự ựa dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu cho lai tạọ
Nhóm chỉ thị phân tử DNA dựa trên cơ sở khuyếch ựại gen mong muốn bằng kỹ thuật PCR là: RAPD, AFLP, SSR, STS, Ầ Trong những năm gần ựây, nhiều chỉ thị thuộc nhóm này ựã thành công trong ựánh dấu hệ gen thực vật và trong nghiên cứu ựa dạng di truyền thực vật.
* Chỉ thị RAPD ( Random Amplified Polymorphism DNA )
RAPD là kỹ thuật nhân DNA dựa trên cơ sở PCR, bằng cách sử dụng các cặp mồi ngắn ( khoảng 10 nucleotide ) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những ựoạn DNA theo nguyên tắc bổ sung.
Nguyên tắc chung:
Theo nguyên lý 1 mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotide thì xác suất bắt cặp bằng Ử10 = 1/1048576, nghĩa là một ựoạn DNA khuôn có 1048576 cặp
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 20 nucleotide có một trình tự bắt cặp với mồi, nghĩa là có thể có 262 ựoạn DNA ựược nhân bộị Trong thực tế, số lượng ựoạn DNA ựược nhân bội nhỏ hơn nhiều vì còn phụ thuộc vào ựộ dài ựoạn ựược nhân bội và sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi trên DNA của bộ gen.
Khi hai cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD ở ựiều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các ựoạn bằng nhau và chiều dài các ựoạn tương ứng bằng nhaụ Khi có ựột biến làm xuất hiện hay mất ựi một vị trắ bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các ựoạn DNA khác nhau giữa các cá thể. Vì vậy, kỹ thuật RAPD có thể phát hiện ựột biến. Chỉ thị RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trộị
Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng giống như nguyên tắc của phản ứng PCR thông thường. Tuy nhiên, vì sử dụng mồi ngẫu nhiên nên nhiệt ựộ bắt cặp mồi thấp ựể tạo ựiều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt. Nhiệt ựộ bắt cặp của phản ứng là 30OC Ờ 36OC, chắnh vì yếu tố ựặc hiệu thấp nên kết quả của RAPD thường có ựộ lặp lại không cao và khó tối ưu phản ứng. đây chắnh là trở ngại lớn nhất của RAPD. Kết quả RAPD phụ thuộc rất nhiều vào thành phần trong phản ứng RAPD ( ựặc biệt là thành phần Mg2+ và chất lượng DNA bản mẫu ), các thiết bị cũng như thao tác thắ nghiệm.
* Chỉ thị SSR ( Simple Sequence Repeates )
Chỉ thị SSR là những ựoạn DNA ựược lặp lại một cách có trật tự, gồm những ựơn vị lặp lại gồm từ 1 ựến 6 nucleotidẹ Bản chất ựa hình của SSR có thể ựược sinh ra do sự nhân bội của DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 ựoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai ựầu của vùng lặp lạị Ưu ựiểm của chỉ thị SSR là sự ựa hình thể hiện ở rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất ựồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR. Những chuỗi ựa hình ựơn giản này ựã ựược ứng dụng trong việc lập bản ựồ ở cả hai ựối tượng ựộng vật và thực vật. Ở người, SSR ựược gọi là thế hệ thứ 2 của các chỉ thị phân tử. Ở thực vật, tần số và số lượng SSR ựã ựược xác ựịnh trên các cây
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 21 rừng nhiệt ựới, cây bắp cải, lúa mỳ và 34 giống cây trồng khác.
* AFLP (Amplified fragment lenght polymorphism):
được Vos và cộng sự ựề xuất năm 1995. Phương pháp này tiến hành trên cơ sở kết hợp của phương pháp RFLP và RAPD, ựầu tiên người ta dùng enzym cắt hạn chế ựể cắt ựoạn DNA, sau ựó ựắnh thêm ựoạn DNA adapter dựa trên trình tự cắt của enzym, thiết kế ựoạn mồi trên cơ sở ựoạn adapter có chọn lọc thêm 1 - 2 nucleotit ngẫu nhiên gắn thêm vào ựầu 3' của adapter, dùng phản ứng PCR ựể nhân các ựoạn cắt, tạo ra sự ựa hình các ựoạn DNA ựược nhân bản.
* ALP (Amplicon length polymorphism):
Sự ựa hình chiều dài những ựoạn DNA ựược nhân bản trên cơ sở phương pháp PCR.
* Lai DNA/DNA (Phương pháp RFLP ựa hình các ựoạn cắt giới hạn):
Dùng các enzyme cắt giới hạn (RE: restriction enzym) cắt các trình tự gen thành các ựoạn ngắn, ựiện di sản phẩm và phát hiện bằng các mẫu dò ựặc hiệu ựể nhận dạng gen.