Thành phần phản ứng PCR gồm:
1. Buffer ( 10X ) : 2,0ộl 2. dNTPs ( 2,5 mM ) : 0,4ộl 3. primer ( 5u/ ộl ): 2ộl
4. Taq Ờpolymerase ( 20pmol/ộl ): 0,2ộl 5. Nước cất vô trùng : 14,4ộl
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
Phản ứng PCR (RAPD và SSR) ựược thực hiện bởi chu trình nhiệt:
Bảng 3.5. Chu trình nhiệt nhân ựoạn DNA Giai ựoạn Nhiệt ựộ
( 0C ) Thời gian Tác dụng Chu kỳ
I 94 5 phút Biến tắnh 1 94 1 phút Biến tắnh 36 (52) 40 giây Gắn mồi II 72 1 phút Tổng hợp 35 III 72 4 phút Tổng hợp 1 IV 4 Bảo quản
Phương pháp ựiện di DNA trên gel Agarose
Sản phẩm nhân PCR ựược ựi ựiện di trên bản gel Agarose 1,5-2,0%, sau ựó bản gel ựi nhuộm bằng dung dịch ethidium bromide 1,0% trong 10 Ờ 15 phút rồi quan sát chúng dưới ựèn tia UV.
Cách tiến hành:
- Cân 1,5g Agarose cho vào bình thủy tinh, sau ựó ựong 100ml TAE 1x cho tiếp vào bình.
- đun sôi trong lò vi song ựến khi tạo thành dung dịch trong suốt ựồng nhất.
- đổ agar vào khuôn sao cho không có bọt khắ, chờ gel ựông sau ựó chuyển khuôn agarose vào bể ựiện di ( bể ựiện di chứa ựệm chạy TAE sao cho ựệm ngập khuôn agarose khoảng 2mm), sau ựó rút lược rạ
- Trộn 14ộl sản phẩm PCR với 1ộl loading dye sau ựó tra vào giếng.
- Chạy ựiện di sau khi tra mẫu, chạy ựiện di với nguồn ựiện 60 Ờ 65V trong khoảng thời gian 1,5 Ờ 2 giờ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36 Ethidium bromide (chất này xen vào giữa các bazo của DNA và phát huỳnh quang khi chiếu tia tử ngoại ) trên máy lắc khoản 10 Ờ 15 phút.
- Chụp bằng tia UV và quan sát ựể lấy ảnh.
3.2.2.4. Sử dụng phần mềm NTSYSpc2.1
- Kết quả chạy RAPD và SSR ựược nhập vào chương trình excel theo nguyên tắc: Nếu không xuất hiện năng ghi Ộ0Ợ, nếu xuất hiện băng nghi Ộ1Ợ.
- Số liệu ựược xử lý tiếp trong chương trình Notepad.
- Ma trận tương ựồng và sơ ựồ hình cây ựược xây dựng sau khi xử lý trong NTSYSpe 2.1.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu sự ựa dạng về các ựặc ựiểm nông sinh học
4.1.1. Phân loại mẫu giống theo ựiều kiện sinh thái
Phân loại mẫu giống theo ựiều kiện sinh thái nơi thu thập mẫu có ý nghĩa trong công tác chọn vật liệu khởi ựầu cho lai tạo hay xử lý ựột biến. Những giống thu ựược ở vùng ựất dốc, cao thường chịu hạn tốt; các giống thu ựược ở ựộ cao có tắnh chịu lạnh sương mù tốt. Các dạng trung gian giữa khoai môn và khoai sọ thường có kắch thước củ con gần bằng củ cái nên có giá trị thương phẩm cao, ựây là nguồn vật liệu tốt ựể chọn tạo giống khoai sọ có củ cái nhỏ, năng suất caọ Kết quả phân loại 60 mẫu giống trình bày ở bảng 4.1a và 4.1b.
Từ bảng 4.1a và 4.1b cho thấy, nếu phân loại theo ựiều kiện sống thì 60 mẫu giống thu thập ựược chia thành 2 nhóm. Nhóm 1 là những giống sống trong ựiều kiện không ngập, bao gồm 35 mẫu giống chiếm 58,3%. Những mẫu giống này phần lớn ựược thu thập ở vùng ựồng bằng và trung dụ Nhóm 2 là những giống sống trong ựiều kiện dốc, bao gồm 25 mẫu giống chiếm 41,7%. Những giống này ựược thu thập ở những vùng núi cao, ruộng bậc thang, ựược bà con các dân tộc trồng là chủ yếụ Một ựặc ựiểm vô cùng qúy giá là các giống thu thập ở vùng cao khi ựưa về trồng ở ựồng bằng chúng sinh trưởng và phát triển rất tốt, củ to và cho năng suất caọ Có lẽ trong ựiều kiện ựồng bằng, ựất tốt, lại không bị hạn lên chúng sinh trưởng và phát triển tốt.
Nếu phân loại theo ựộ cao thì 60 mẫu giống ựược chia thành 3 nhóm. Nhóm 1 phân bố ở ựộ cao thấp (nhỏ hơn 500 m), bao gồm các mẫu giống có nguồn gốc từ ựồng bằng gồm 11 mẫu giống chiếm 18,3%, các mẫu giống nhóm này chủ yếu ựược thập ở các tỉnh thuộc ựồng bằng Bắc bô. Nhóm 2 phân bố ở ựộ cao trung bình từ 500-1000 m bao gốm 27 mẫu giống, chiếm 45%. Nhóm này gồm các mẫu giống ựược thu thập ở trung du và miền núị Nhóm 3 ựược phân bố ở ựộ cao trên 1000m, bao gồm 22 mẫu giống, chiếm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38 36,7%. Nhóm này chủ yếu là các mẫu giống thu ở khu vực miền núị Qua ựây chúng tôi nhận thấy rằng các giống khoai môn-sọ ựược trồng chủ yếu ở các vùng trung du và vùng núị
4.1. Phân loại mẫu giống theo ựiều kiện sinh thái ( Số thứ tự cũng là số ký hiệu của mẫu giống) hiệu của mẫu giống)
Bảng 4.1. Loại mẫu giống theo ựiều kiện sinh thái
STT điều kiện sống độ cao phân
bố STT điều kiện sống độ cao phân bố 1. R. không ngập Thấp 31. R. không ngập TB 2. R. không ngập Thấp 32. Dốc Cao 3. Dốc TB 33. Dốc Cao 4. Dốc Cao 34. Dốc Cao 5. R. không ngâp TB 35. Dốc TB 6. Dốc Cao 36. R. không ngập Thấp 7. R. không ngập TB 37. R. không ngập Thấp 8. R. không ngập TB 38. R. không ngập Thấp 9. Dốc Thấp 39. R. không ngập TB 10. Dốc Cao 40. R. không ngập Thấp 11. Dốc Cao 41. Dốc Cao 12. Dốc Cao 42. Dốc Cao 13. R. không ngập TB 43. R. không ngập TB 14. R. không ngập TB 44. Dốc Cao 15. R. không ngập TB 45. Dốc Cao 16. Dốc Cao 46. Dốc Cao 17. R. không ngập TB 47. R. không ngập TB 18. R. không ngập TB 48. R. không ngập TB 19. Dốc Cao 49. Dốc Cao 20. Dốc Cao 50. Dốc Cao 21. R. không ngập TB 51. Dốc Cao 22. R. không ngập TB 52. R. không ngập Thấp 23. R. không ngập TB 53. R. không ngập Thấp 24. R. không ngập TB 54. R. không ngập Thấp 25. R. không ngập TB 55. R. không ngập Thấp 26. R. không ngập TB 56. R. không ngập TB 27. R. không ngập TB 57. R. không ngập TB 28. Dốc Cao 58. R. không ngập TB 29. Dốc Cao 59. R. không ngập TB 30. R. không ngập TB 60. Dốc Cao
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
R. không ngập: Ruộng không ngập
Như vậy các mẫu giống khoan môn - sọ rất ựa dạng. đa dạng về ựiều kiện sống cũng như ựa dạng về phân bố ựộ caọ đây là nguồn gen vô cùng quý giá trong chương trình bảo tồn và chọn tạo giống khoai môn sọ.
Bảng 4.2. Tỷ lệ phân bố của các giống khoai môn - sọ
Cơ sở phân loại Số mẫu giống Tỷ lệ %