3. Nội dung nghiên cứu
3.2.3.Tạo vector chuyển gen pBI121 mang cấu trúc GmDREB2
Plasmid pBI121 là một dạng Ti-plasmid trong Agrobacterium tumefaciens đã được cải biến bằng cách loại bỏ gen gây độc và gắn vào gen kháng kháng sinh để chọn lọc phù hợp với việc chuyển gen vào tế bào thực vật. Chúng tôi sử dụng cùng một loại enzym là XbaI và SacI để xử lý cả hai cấu trúc là plasmid pBI121 và GmDREB2 nên chúng dễ dàng có thể được ghép nối lại với nhau nhờ enzym T4 ligase.
Thành phần của phản ứng ghép nối gồm: H2O: 2 μl; BufferT4: 1 μl; T4 ligase: 1 μl; GmDREB2: 4 μl; plasmid pBI121 : 2 μl. Phản ứng này được thực hiện ở 220C trong thời gian từ 3 giờ. Sau đó, chúng tôi tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp trên vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lượng lớn. Kết quả biến nạp vào
E. coli DH5α cho thấy có nhiều khuẩn lạc sống sót được trên môi trường có các kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l, chứng tỏ việc biến nạp trên đã thành công.
Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR
Để kiểm tra xem các khuẩn lạc có mang vector tái tổ hợp hay không, chúng tôi tiến hành chọn 3 khuẩn lạc riêng rẽ, tròn đều, từ đĩa khuẩn trên để tiến hành tách plasmid, sau đó thực hiện phản ứng PCR plasmid với mồi đặc hiệu. Kết quả colony- PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agrose 0,8% thể hiện ở hình 3.10. Qua hình ảnh cho thấy cả 3 mẫu plasmid tách chiết từ E. coli DH5α đã biến nạp vector tái tổ hợp pBI121/GmDREB2 đều cho kết quả dương tính, xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 480 bp. Như vậy
3 mẫu plasmid mang cấu trúc pBI121/GmDREB2 đều có thể sử dụng tốt cho thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.10. Hình điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc mang plasmid pBI121/GmDREB2 tái tổ hợp; Giếng 1-3: các dòng khuẩn lạc
mang plasmid pBI121/GmDREB2 tái tổ hợp; M: thang chuẩn 1 kb
Từ các khuẩn lạc đã được kiểm tra dương tính, chúng tôi tiến hành nuôi lỏng trên môi trường có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l, khuẩn được nuôi trên máy lắc 200 v/p ở nhiệt độ 370C trong thời gian 16 giờ. Sau đó, chúng tôi tiến hành tách plasmid bảo quản ở - 200C để sử dụng biến nạp tiếp vào A. tumefaciens làm công cụ chuyển gen.