3. Nội dung nghiên cứu
1.3. CHUYỂN GEN VÀ VECTOR CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
1.3.1. Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp và gián tiếp ở thực vật
Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế dạng plasmid tái tổ hợp, hoặc được gắn vào hệ gen của tế bào
chủ. Trong tế bào chủ, gen lạ hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng, từ đó xuất hiện đặc tính mới của cơ thể đã mang gen chuyển. Muốn chuyển gen lạ vào tế bào thực vật chủ, phải gắn gen mong muốn chuyển vào vector. Các vector chuyển gen càng nhỏ càng tốt vì chúng dễ xâm nhập vào tế bào. Vector phải có khả năng tự sao chép, nhờ đó gen lạ cũng được sao chép cùng với DNA vector. Đồng thời vector phải được gắn gen chỉ thị chọn lọc, ví dụ, gen kháng với kháng sinh hoặc gen chỉ thị màu. Vector phải có một hay một vài đoạn trình tự nhận biết và cắt của enzyme giới hạn tạo vị trí ghép nối với DNA để tạo DNA tái tổ hợp [1], [4], [16].
Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp.
Ở phương pháp chuyển gen gián tiếp, gen được chuyển vào tế bào thực vật qua một sinh vật trung gian, thường là vi sinh vật hoặc virus. Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen được chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật thông qua những thiết bị hoặc máy móc nhất định mà không cần phải nhờ các sinh vật trung gian [4], [11], [16].
Các phương pháp chuyển gen trực tiếp được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật có thể kể đến là (i) Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện, (ii) Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm, (iii) Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn, (iv) Chuyển gen nhờ súng bắn gen, (v) Chuyển gen nhờ kĩ thuật siêu âm và (vi) Chuyển gen nhờ silicon carbide.
Khác với các phương pháp chuyển gen trực tiếp ở thực vật, phương pháp chuyển gen gián tiếp được thông qua một vi sinh vật trung gian mang gen chuyển. Những sinh vật này tiến hành quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật thông qua các cơ chế rất tự nhiên. Một trong những phương pháp
chuyển gen gián tiếp ở thực vật được sử dụng, nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến là phương pháp chuyển gen thông qua loài vi khuẩn đất là
Agrobacterium.
Chuyển gen gián tiếp ở thực vật bao gồm những bước tiến hành chính như sau:
(1) Xác định thông tin về gen liên quan đến đặc tính trạng quan tâm; (2) Phân lập gen;
(3) Thiết kế vector chuyển gen;
(4) Tạo vi khuẩn mang cấu trúc gen chuyển; (5) Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật; (6) Chọn lọc các thể biến nạp;
(7) Tái sinh cây biến nạp;
(8) Phân tích cây chuyển gen [10], [12].
1.3.2. Hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn
Agrobacterium
Có hai hệ thống vector dùng cho chuyển gen thông qua A. tumefaciens
là hệ thống vector liên hợp và hệ thống vector nhị thể.
Vector liên hợp (cointegrate)
Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn. Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T – DNA lên một vector nhỏ hơn. Điều này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ. Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên kết. Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở dạng T – DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh). Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid
cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm cho việc sao chép bền vững của plasmid trong A. tumefaciens.
Vector liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng của một vector thông thường khác của E. coli, và thường gồm những phần sau:
i) Một vị trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI), thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli;
ii) Gen chỉ thị có tính kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli và A. tumefaciens;
iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật;
iv) Đoạn khởi đầu của E. coli, không hoạt động ở A. tumefaciens. Như vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai có chỗ cho GOI đi nhờ như một hành khách vào trong tế bào thực vật [1], [4], [10].
Vector nhị thể (binary vector)
Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA.
Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A. tumefaciens, loại vector nhị thể được thiết kế bao gồm các phần như sau:
i) Vị trí ghép nối đa điểm;
ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật.;
iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A. tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp;
v) Đoạn T – DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T – DNA.
Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật [1], [12], [16].
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Nguyên liệu thực vật
Giống đậu tương được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu là DT2008 là giống chịu hạn do Viện Di truyền nông nghiệp cung cấp. Hạt có dạng hình cầu, màu vàng nhạt, rốn hạt có màu nâu, kích thước rốn là 4 mm (Hình 2.1).
Hình 2.1. Ảnh hạt của giống đậu tương DT2008
Giống đậu tương DT2008 là giống lai giữa giống DT2001 và giống HC100 (gốc Mexico) kết hợp với phương pháp đột biến thực nghiệm và chọn lọc theo tiêu chuẩn thích ứng và chống chịu. DT2008 có hoa tím, lông nâu, vỏ quả vàng, hạt vàng, rốn hạt màu đen, chất lượng tốt, hàm lượng protein 40%. Giống đậu tương chịu hạn DT2008 thuộc dạng hình cao cây, phân cành khỏe, số quả chắc trên cây từ 35 – 200 quả, tỷ lệ hạt/quả từ 2,0 – 2,2, năng suất 20 – 40 tạ/ha, có khả năng chịu hạn tốt. Giống đậu tương DT2008 có thể canh tác trong vụ xuân, vụ hè thu, vụ đông và vụ đông xuân.
Các vector, chủng vi khuẩn và cặp mồi sử dụng
Vector pBT; vector pBI121 do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam cung cấp (Hình 2.2).
Chủng vi khuẩn E.coli DH5α và Agrobacterium tumefaciens do phòng Công nghệ tế bào thực vật của viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Plasmid pBT Plasmid pBI121
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu
Cặp mồi: DREB2-F/R được tổng hợp bởi hãng Bioneer (Hàn Quốc) có trình tự như sau:
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Mồi Trình tự
DREB2-F 5’-ATG GAA GAA GCG GGT TTA G -3’
DREB2-R 5’-CTA ATC TTC AGG TTT GGG ATA C -3’
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Hoá chất
Trizol Reagents Kit (của hãng Invitrogen) để tách chiết RNA; Plasmid Extraction Kit (của hãng Bioneer, Hàn Quốc); các enzyme hạn chế của hãng Fermentas (Hàn Quốc).
KCl, Tris HCl, MgCl2, MgSO4, EDTA, NaOH, CaCl2, NaCl, X- gal, Glycerol, Ethanol 70%, yeast extract, agarose, glucose, nước khử ion.
Các loại kháng sinh: carbenicillin, kanamycin, rifamycin…
Thiết bị
Máy PCR System 9700 (Appied Biosytem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini – transllumminatior, Bio- Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển) máy vortex (Mimeshaker, IKA, Đức), máy li tâm, máy sung điện Gen Plulser, cùng nhiều trang thiết bị khác.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ DNA ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
Đề tài luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện đại, khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phân lập gen 2.2.1. Phân lập gen
2.2.1.1. Phương pháp tách chiết RNA
Sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Hãng Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá đậu tương theo chỉ dẫn của nhà sản xuất gồm các bước:
Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng.
Thêm 1ml Trizol Reagents, đảo nhẹ đều trong 5 phút.
Thêm 200 μl C:I (24:1), đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 10.000 vòng/15 phút/40C.
Thu 500 μl dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5ml. Bổ sung 500 μl Isopropanol 40C đảo đều 15 phút ở 250C. Li tâm 10.000 vòng/15 phút.
Thu tủa bổ sung 700 μl cồn 70% (cồn pha nước DEPC 0.01%), li tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, làm hai lần.
Làm khô RNA ở nhiệt độ phòng.
Bổ sung 40 μl nước + DEPC 0.01%, ủ ở nhiệt độ 550/15 phút.
Kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết được bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.2.1.2. Phương pháp tổng hợp cDNA
Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số được thực hiện theo phản ứng phiên mã ngược với thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA
STT Thành phần Thể tích
1 RNA tổng số (10-20 ng/μl) 5 μl
2 Primese ranolome hexamine (250 ng) 1 μl
3 DEPC Water 6 μl
Tổng thể tích 12 μl
Ủ ở 650C/5 phút sau đó cho ngay vào đá lạnh.
Bổ sung: Reaction Buffer 4 μl; ReboleckTM Rnase Trizone Regents 1 μl; dNTP 2 μl; RTase 1μl.
Cho vào máy PCR theo chu trình nhiệt: 250C/15 phút; 420C/60 phút; 700C/5 phút.
2.2.1.3. Phương pháp PCR
cDNA của gen GmDREB2 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu theo thành phần phản ứng ở bảng 2.3 và chu trình nhiệt ở bảng 2.4. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích 1 Nước khử ion 12,5 μl 2 Đệm PCR 10X 2,5 μl 3 Mg2+ (25mM) 2,5 μl 4 dNTPs (25mM) 2,5 μl 5 DREB2F (10 pmol/ μl) 1 μl 6 DREB2R (10 pmol/ μl) 1 μl
7 Taq DNA polymerase (5 đơn vị/ μl) 1 μl
8 cDNA khuôn (10 - 20 ng/ μl) 2 μl
Tổng thể tích 25 μl
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 950 4 phút 1
2 Biến tính 950 30 giây
3 Gắn mồi 570 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 720 45 giây
30
5 Hoàn tất kéo dài 720 7 phút 1
2.2.1.4. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR)
Sau khi nuôi đĩa khuẩn đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, thấy xuất hiện nhiều khuẩn lạc trắng. Chọn ra một số khuẩn lạc trắng để chạy phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu để xác định khuẩn lạc có mang đoạn gen đưa vào. Thành phần và chu kỳ nhiệt cũng giống như phản ứng PCR nhân gen mục (2.2.1.3), mẫu DNA được thay bằng khuẩn lạc. Sản phẩm được điện di trên gel agarose 0,8% để chọn ra những khuẩn lạc mang gen có kích thước mong muốn.
2.2.1.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Quá trình tinh sạch sản phẩm PCR được thực hiện theo quy trình và bộ hóa chất sử dụng cho tinh sạch của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit), gồm các bước sau:
Thêm Buding buffer và sản phẩm PCR tỉ lệ 1: 1, ủ 550C/10 phút. Chuyển sang cột lọc li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. Bổ sung Wash buffer li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml mở nắp 5 phút.
Bổ sung nước khử ion để 5 phút li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây thu dịch bảo quản ở - 200C.
2.2.1.6. Phương pháp ghép nối gen đích vào plasmid
Tiến hành ghép nối gen GmDREB2 vào vector tách dòng pBT với thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần gắn gen GmDREB2 vào vector tách dòng pBT
STT Thành phần Thể tích 1 cDNA (10 - 20 ng/ μl) 7 μl 2 Ligation buffer 10X 1 μl 3 Vector pBT (30 ng/μl) 1 μl 4 T4 ligase (1U/μl) 1 μl Tổng thể tích phản ứng 10 μl
Bổ sung lần lượt các thành phần của phản ứng vào ống eppendorf 0,5 ml, ủ ở 220C trong 3 giờ. Biến nạp sản phẩm ghép nối vào E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Cấy trải 100 μl dịch biến nạp trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc (carbenicillin). Nuôi qua đêm ở 370C.
2.2.1.7. Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp
Phương pháp tách chiết plasmid được thực hiện theo Sambrook và cs (2001), thành phần hóa chất thể hiện ở bảng 2.6.
Bảng 2.6. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid
STT Thành phần
Sol I 50 mM glucose ; 25 mM Tris HCl pH 8 ; 10mM EDTA pH 8 Sol II 0,2 NaOH; SDS 1%
Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H2O
Các bước tiến hành tách plasmid:
Lấy 10 ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng 12 - 16 giờ.
Ly tâm 8000 v/p thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn của 10 ml dịch khuẩn.
Bổ sung 200 μl Sol I hòa tan tế bào hoàn toàn. Bổ sung 400 μl Sol II trọn nhẹ trong 30 giây. Bổ sung tiếp 300 μl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.
Bổ sung 900 μl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút. Ly tâm 13000v/p, hút nhẹ nhàng không cặn 900μl pha trên sang ống effendorf mới.
Cho 900 μl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -40C trong 30 – 180 phút, ly tâm 13000 v/p, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.
Cho 500 μl cồn 70% vào, ly tâm 7000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn và làm đông khô trong 30 phút.
Hòa tan sản phẩm trong 50 μl nước khử ion. Bổ sung Rnase.
Ủ ở 370C trong 30 phút.
Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.2.1.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của gen
Trình tự của gen được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.2.2. Phương pháp thiết kế vector
Các công đoạn sử dụng trong thiết kế vector:
Sử dụng enzym XbaI và SacI để cắt lấy đoạn gen đích đã được chuyển vào plasmid pBT;
Dùng enzym XbaI và SacI để cắt mở vòng plasmid pBI121;
Ghép nối đoạn gen đích đã được cắt bằng enzym XbaI và SacI vào plasmid pBI121 mở vòng.
Sơ đồ thiết kế vector được thể hiện trong hình 2.3.
Plasmid pBT/GmDREB2
Plasmid pBI121/gus
GmDREB2 pBI121 mở vòng
Vector chuyển gen pBI121/GmDREB2
XbaI + SacI
Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen
2.2.3. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào A. tumefaciens
Rửa Cuvette bằng cồn 700, rửa lại bằng nước khử ion vô trùng rồi sấy khô. Tế bào khả biến đặt trong nước đá (khoảng 40C), 15 phút.
Bổ sung 1 μl plasmid vào 50 μl tế bào khả biến và trộn nhẹ.
Chuyển tất cả hỗn hợp dịch tế bào khả biến và plasmid vào Cuvette. Chỉnh thông số máy xung điện: 2,5 kV, 25 μF, 200 Ω.
Tiến hành chạy xung điện.
Lấy Cuvete ra bổ sung 500 μl LB lỏng và mix nhẹ. Chuyển sang ống eppendoff 2 ml.
Nuôi lắc ở 280C trong 1 giờ.
Chuyển dịch ra đĩa môi trường LB đặc bổ sung 100 mg/l rifamycin, 50 mg/l kanamycin.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP GEN GmDREB2 TỪ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN DT2008 DT2008
3.1.1. Nhân bản gen GmDREB2 từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR
Chúng tôi sử dụng bộ Kit Trizol Reagents (của hãng Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá đậu tương theo chỉ dẫn của nhà sản xuất, sau đó tổng hợp cDNA bằng phản ứng phiên mã ngược nhờ enzym reverse transcriptase (RT-ase). Sản phẩm cDNA được sử dụng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn mã hoá (cDNA) của gen GmDREB2 với cặp mồi đặc hiệu.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose với thang