3. Nội dung nghiên cứu
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phân lập gen
2.2.1.1. Phương pháp tách chiết RNA
Sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Hãng Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá đậu tương theo chỉ dẫn của nhà sản xuất gồm các bước:
Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng.
Thêm 1ml Trizol Reagents, đảo nhẹ đều trong 5 phút.
Thêm 200 μl C:I (24:1), đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 10.000 vòng/15 phút/40C.
Thu 500 μl dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5ml. Bổ sung 500 μl Isopropanol 40C đảo đều 15 phút ở 250C. Li tâm 10.000 vòng/15 phút.
Thu tủa bổ sung 700 μl cồn 70% (cồn pha nước DEPC 0.01%), li tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, làm hai lần.
Làm khô RNA ở nhiệt độ phòng.
Bổ sung 40 μl nước + DEPC 0.01%, ủ ở nhiệt độ 550/15 phút.
Kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết được bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.2.1.2. Phương pháp tổng hợp cDNA
Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số được thực hiện theo phản ứng phiên mã ngược với thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA
STT Thành phần Thể tích
1 RNA tổng số (10-20 ng/μl) 5 μl
2 Primese ranolome hexamine (250 ng) 1 μl
3 DEPC Water 6 μl
Tổng thể tích 12 μl
Ủ ở 650C/5 phút sau đó cho ngay vào đá lạnh.
Bổ sung: Reaction Buffer 4 μl; ReboleckTM Rnase Trizone Regents 1 μl; dNTP 2 μl; RTase 1μl.
Cho vào máy PCR theo chu trình nhiệt: 250C/15 phút; 420C/60 phút; 700C/5 phút.
2.2.1.3. Phương pháp PCR
cDNA của gen GmDREB2 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu theo thành phần phản ứng ở bảng 2.3 và chu trình nhiệt ở bảng 2.4. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích 1 Nước khử ion 12,5 μl 2 Đệm PCR 10X 2,5 μl 3 Mg2+ (25mM) 2,5 μl 4 dNTPs (25mM) 2,5 μl 5 DREB2F (10 pmol/ μl) 1 μl 6 DREB2R (10 pmol/ μl) 1 μl
7 Taq DNA polymerase (5 đơn vị/ μl) 1 μl
8 cDNA khuôn (10 - 20 ng/ μl) 2 μl
Tổng thể tích 25 μl
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 950 4 phút 1
2 Biến tính 950 30 giây
3 Gắn mồi 570 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 720 45 giây
30
5 Hoàn tất kéo dài 720 7 phút 1
2.2.1.4. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR)
Sau khi nuôi đĩa khuẩn đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, thấy xuất hiện nhiều khuẩn lạc trắng. Chọn ra một số khuẩn lạc trắng để chạy phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu để xác định khuẩn lạc có mang đoạn gen đưa vào. Thành phần và chu kỳ nhiệt cũng giống như phản ứng PCR nhân gen mục (2.2.1.3), mẫu DNA được thay bằng khuẩn lạc. Sản phẩm được điện di trên gel agarose 0,8% để chọn ra những khuẩn lạc mang gen có kích thước mong muốn.
2.2.1.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Quá trình tinh sạch sản phẩm PCR được thực hiện theo quy trình và bộ hóa chất sử dụng cho tinh sạch của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit), gồm các bước sau:
Thêm Buding buffer và sản phẩm PCR tỉ lệ 1: 1, ủ 550C/10 phút. Chuyển sang cột lọc li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. Bổ sung Wash buffer li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml mở nắp 5 phút.
Bổ sung nước khử ion để 5 phút li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây thu dịch bảo quản ở - 200C.
2.2.1.6. Phương pháp ghép nối gen đích vào plasmid
Tiến hành ghép nối gen GmDREB2 vào vector tách dòng pBT với thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần gắn gen GmDREB2 vào vector tách dòng pBT
STT Thành phần Thể tích 1 cDNA (10 - 20 ng/ μl) 7 μl 2 Ligation buffer 10X 1 μl 3 Vector pBT (30 ng/μl) 1 μl 4 T4 ligase (1U/μl) 1 μl Tổng thể tích phản ứng 10 μl
Bổ sung lần lượt các thành phần của phản ứng vào ống eppendorf 0,5 ml, ủ ở 220C trong 3 giờ. Biến nạp sản phẩm ghép nối vào E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Cấy trải 100 μl dịch biến nạp trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc (carbenicillin). Nuôi qua đêm ở 370C.
2.2.1.7. Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp
Phương pháp tách chiết plasmid được thực hiện theo Sambrook và cs (2001), thành phần hóa chất thể hiện ở bảng 2.6.
Bảng 2.6. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid
STT Thành phần
Sol I 50 mM glucose ; 25 mM Tris HCl pH 8 ; 10mM EDTA pH 8 Sol II 0,2 NaOH; SDS 1%
Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H2O
Các bước tiến hành tách plasmid:
Lấy 10 ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng 12 - 16 giờ.
Ly tâm 8000 v/p thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn của 10 ml dịch khuẩn.
Bổ sung 200 μl Sol I hòa tan tế bào hoàn toàn. Bổ sung 400 μl Sol II trọn nhẹ trong 30 giây. Bổ sung tiếp 300 μl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.
Bổ sung 900 μl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút. Ly tâm 13000v/p, hút nhẹ nhàng không cặn 900μl pha trên sang ống effendorf mới.
Cho 900 μl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -40C trong 30 – 180 phút, ly tâm 13000 v/p, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.
Cho 500 μl cồn 70% vào, ly tâm 7000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn và làm đông khô trong 30 phút.
Hòa tan sản phẩm trong 50 μl nước khử ion. Bổ sung Rnase.
Ủ ở 370C trong 30 phút.
Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.2.1.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của gen
Trình tự của gen được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.2.2. Phương pháp thiết kế vector
Các công đoạn sử dụng trong thiết kế vector:
Sử dụng enzym XbaI và SacI để cắt lấy đoạn gen đích đã được chuyển vào plasmid pBT;
Dùng enzym XbaI và SacI để cắt mở vòng plasmid pBI121;
Ghép nối đoạn gen đích đã được cắt bằng enzym XbaI và SacI vào plasmid pBI121 mở vòng.
Sơ đồ thiết kế vector được thể hiện trong hình 2.3.
Plasmid pBT/GmDREB2
Plasmid pBI121/gus
GmDREB2 pBI121 mở vòng
Vector chuyển gen pBI121/GmDREB2
XbaI + SacI
Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen
2.2.3. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào A. tumefaciens
Rửa Cuvette bằng cồn 700, rửa lại bằng nước khử ion vô trùng rồi sấy khô. Tế bào khả biến đặt trong nước đá (khoảng 40C), 15 phút.
Bổ sung 1 μl plasmid vào 50 μl tế bào khả biến và trộn nhẹ.
Chuyển tất cả hỗn hợp dịch tế bào khả biến và plasmid vào Cuvette. Chỉnh thông số máy xung điện: 2,5 kV, 25 μF, 200 Ω.
Tiến hành chạy xung điện.
Lấy Cuvete ra bổ sung 500 μl LB lỏng và mix nhẹ. Chuyển sang ống eppendoff 2 ml.
Nuôi lắc ở 280C trong 1 giờ.
Chuyển dịch ra đĩa môi trường LB đặc bổ sung 100 mg/l rifamycin, 50 mg/l kanamycin.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP GEN GmDREB2 TỪ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN DT2008 DT2008
3.1.1. Nhân bản gen GmDREB2 từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR
Chúng tôi sử dụng bộ Kit Trizol Reagents (của hãng Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá đậu tương theo chỉ dẫn của nhà sản xuất, sau đó tổng hợp cDNA bằng phản ứng phiên mã ngược nhờ enzym reverse transcriptase (RT-ase). Sản phẩm cDNA được sử dụng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn mã hoá (cDNA) của gen GmDREB2 với cặp mồi đặc hiệu.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose với thang DNA chuẩn 1 kb (Hình 3.1). Kết quả ở Hình 3.1 cho thấy có một băng DNA rõ nét với kích thước khoảng 0,48 kb, đúng như tính toán theo lý thuyết.
Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hoá gen
GmDREB2; giếng 1-2: các mẫu cDNA; M: thang chuẩn 1kb
M 1 2
3.1.2. Tách dòng đoạn mã hoá (cDNA) của gen GmDREB2
Để thu đoạn mã hoá của gen GmDREB2 chúng tôi tiến hành cắt băng DNA mong muốn để tinh sạch. Quá trình tinh sạch được thực hiện theo quy trình và bộ hóa chất sử dụng của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit), kết quả thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch đoạn mã hoá của gen GmDREB2; M: thang chuẩn 1kb
Kết quả tinh sạch đoạn DNA ở hình 3.2 cho thấy băng DNA có kích thước khoảng 0,48 kb đúng với kích thước cuả gen GmDREB2, đủ độ sáng không lẫn tạp chất. Như vậy có thể kết luận là đã thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 0,48 kb, đảm bảo sử dụng tốt cho phản ứng tiếp theo.
Kết quả tạo vector tái tổ hợp
Để tạo được vector tái tổ hợp, chúng tôi thực hiện phản ứng ghép nối (ligation) đoạn gen GmDREB2 vào vector tách dòng pBT, đây là vector có nhiều ưu điểm (có kích thước nhỏ; có nhiều điểm cắt của enzyme giới hạn; có chứa gen kháng kháng sinh carbenicillin giúp cho quá trình chọn lọc đơn giản). Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen GmDREB2 vào vector pBT đã được mở vòng (Bảng 2.5), phản ứng được thực hiện trong ống eppendorf 0,5 ml sau đó để trong điều kiện 220C với thời gian 3 giờ, kết quả đã tạo ra được vector tái tổ hợp.
M GmDREB2
Kết quả tạo tế bào E.coli DH5α tái tổ hợp
Sau đó vector pBT sẽ được biến nạp vào tế bào E.coli DH5α và được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh carbenicillin là đồng phân của ampicillin, cơ chất X-gal, chất cảm ứng IPTG. Sau đó các tế bào này sẽ được nuôi ở 37oC trong 16 giờ. Khi này sẽ có các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng mọc được trên môi trường chọn lọc chứng tỏ chúng đều mang vector pBT. Trong đó khuẩn lạc xanh là các khuẩn lạc mang pBT tự đóng vòng nên chúng vẫn sinh tổng hợp nên protein GUS để phân giải cơ chất X-gal từ không màu thành màu xanh, còn các khuẩn lạc màu trắng do chúng mang vector pBT đã mất gen GUS nên không thể phân giải cơ chất thành màu xanh (Hình 3.3).
Hình 3.3. Ảnh đĩa khuẩn lạc
Tách dòng cDNA của gen GmDREB2
Để kiểm tra xem các dòng khuẩn lạc trắng này có mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn cDNA của GmDREB2, chúng tôi tiến hành phản ứng colony- PCR để sàng lọc, với cặp mồi đặc hiệu. Số lượng khuẩn lạc sau biến nạp rất lớn do đó chúng tôi tiến hành chọn ngẫu nhiên 13 khuẩn lạc trắng có kích thước đều nhau để thực hiện phản ứng colony- PCR. Sản phẩm colony-PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%; kết quả thấy xuất hiện băng DNA mong muốn có kích thước khoảng 0,48 kb, chứng tỏ rằng plasmid mang đoạn gen GmDREB2 (Hình 3.4). Các khuẩn lạc này được chọn dòng phục vụ cho việc đọc trình tự gen.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn cDNA của GmDREB2; giếng 1-13: các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn cDNA của GmDREB2; M:
thang chuẩn 1kb
Tiếp theo chúng tôi mang nuôi các khuẩn lạc đã được chọn lọc trong môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin ( tỉ lệ 1000LB: 1 carbenicillin). Nuôi ở 370C, lắc 200 vòng/phút, trong 16 giờ rồi mang tách plasmid. Sản phẩm tách plasmid được điện di kiểm tra trên gel agrose, kết quả được thể hiện trên hình 3.5.
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid pBT/GmDREB2 tái tổ hợp; Giếng 1-13: plasmid pBT/GmDREB2 của các dòng khuẩn lạc
Kết quả hình 3.5 cho thấy, đã tách thành công plasmid tái tổ hợp, đảm bảo đủ số lượng và chất lượng để phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
0,50 kb 0,48 kb
3.1.3. Kết quả đọc trình tự đoạn mã hoá của gen GmDREB2
Để xác định trình tự đoạn mã hoá của gen GmDREB2 chúng tôi tiến hành đọc trình tự 3 mẫu của cùng một plasmid mang gen đích bằng máy đọc trình tự tự động. Kết quả đã xác định được trình tự gen có kích thước 480 nucleotide mã hoá cho 159 amino acid. Tiến hành so sánh trình tự đoạn mã hoá gen GmDREB2 của DT2008 với trình tự gen mang mã số DQ054363 đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm BioEdit, kết quả được trình bày ở hình 3.6.
Hình 3.6. Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hoá gen GmDREB2 của giống đậu tương DT2008 và DQ054363
Kết quả so sánh trình tự đoạn gen GmDREB2 giữa giống DT2008 và trình tự mang mã số DQ054363 ở (Hình 3.6) cho thấy mức độ tương đồng xác
định được giữa hai trình tự là 96,5%. Tuy nhiên cũng tìm thấy có 17 vị trí nucleotide khác nhau giữa hai trình tự (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Sự sai khác giữa trình tự đoạn gen GmDREB2 của giống đậu tương DT2008 và trình tự có mã số DQ054363 TT Vị trí nucleotide DQ054363 DT2008 1 9 A C 2 36 T G 3 40 A T 4 45 T G 5 57 A G 6 63 G T 7 78 G A 8 202 A G 9 318 G C 10 348 G C 11 405 G C 12 406 A T 13 415 A G 14 416 T C 15 419 G A 16 437 A C 17 441 G C
Tiếp theo chúng tôi tiếp tục so sánh protein suy diễn và kết quả thu được thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7. Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein DREB2 giữa giống DT2008 và AAY89658
Kết quả so sánh trình tự amino acid ở hình 3.7 cho thấy sự tương đồng về amino acid giữa hai trình tự đạt 97,9%, và xuất hiện sự sai khác 10 vị trí amino acid ở các vị trí số 3, 14, 21, 68, 206, 236, 239, 240, 246, 247 (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Sự sai khác giữa trình tự amino acid của protein DREB2 (DT2008) và trình tự có mã số AAY89658
TT Vị trí amino acid AAY89658 DT2008
1 3 E D 2 14 T S 3 21 E D 4 68 T A 5 106 K N 6 136 T S 7 139 I A 8 140 S N 9 146 Y S 10 147 E D
Như vậy, có thể kết luận rằng đã tách dòng thành công và xác định được trình tự đoạn gen GmDREB2 (cDNA) phân lập từ giống đậu tương chịu hạn DT2008.
3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GmDREB2 3.2.1. Kết quả cắt plasmid pBT mang gen GmDREB2 bằng XbaI và SacI 3.2.1. Kết quả cắt plasmid pBT mang gen GmDREB2 bằng XbaI và SacI
Thành phần của phản ứng cắt gồm: H2O: 5 μl; Buffer: 2 μl; XbaI: 1,5 μl; SacI: 1,5 μl; pBT: 10 μl. Ủ ở 370C/16 giờ.
Khi vector pBT được xử lý bằng XbaI và SacI, vector pBT sẽ bị cắt tại hai đầu của gen đích hình thành hai đầu dính khác nhau. Việc xử lý cắt bằng hai enzym khác nhau có ý nghĩa trong việc ngăn cản sự đóng vòng trở lại của vector và thu được cấu trúc gen GmDREB2 có đầu so le. Dự đoán về mặt lý thuyết, sản phẩm cắt của pBT bởi XbaI và SacI khi chụp ảnh điện di sẽ có 2 băng tương ứng với kích thước của vector pBT mở vòng khoảng 2705 bp và kích thước của gen GmDREB2 480 bp. Kết quả phản ứng cắt vector pBT bằng
XbaI và SacI thể hiện trên ảnh điện di.
Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm plasmid pBT/GmDREB2 được cắt bằng XbaI và SacI; thang chuẩn 1 kb
2,705kb
0,48kb 3,0kb
Kết quả hình ảnh cho thấy xuất hiện 2 băng gọn, rõ nét ở vị trí đúng như tính toán lí thuyết, như vậy phản ứng cắt đã thành công. Với mục đích cắt lấy gen đích mang hai đầu dính khác nhau nên chúng tôi đã cắt băng có kích thước khoảng 480 bp để tinh sạch và bảo quản ở - 200C để dùng cho phản ứng tiếp sau.
3.2.2. Kết quả cắt plasmid pBI121 bằng XbaI và SacI
Thành phần của phản ứng cắt gồm: H2O: 19,5 μl; Buffer: 5 μl; XbaI: 2,5 μl; SacI: 3 μl; pBI121: 20 μl. Ủ ở 370C/16 giờ.
Plasmid pBI121 có kích thước 13,0kb; mang một vị trí cắt duy nhất của
XbaI và SacI ở hai đầu gen gus. Với việc xử lý bằng cùng một cặp enzym