3. Nội dung nghiên cứu
3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GmDREB2
Thành phần của phản ứng cắt gồm: H2O: 5 μl; Buffer: 2 μl; XbaI: 1,5 μl; SacI: 1,5 μl; pBT: 10 μl. Ủ ở 370C/16 giờ.
Khi vector pBT được xử lý bằng XbaI và SacI, vector pBT sẽ bị cắt tại hai đầu của gen đích hình thành hai đầu dính khác nhau. Việc xử lý cắt bằng hai enzym khác nhau có ý nghĩa trong việc ngăn cản sự đóng vòng trở lại của vector và thu được cấu trúc gen GmDREB2 có đầu so le. Dự đoán về mặt lý thuyết, sản phẩm cắt của pBT bởi XbaI và SacI khi chụp ảnh điện di sẽ có 2 băng tương ứng với kích thước của vector pBT mở vòng khoảng 2705 bp và kích thước của gen GmDREB2 480 bp. Kết quả phản ứng cắt vector pBT bằng
XbaI và SacI thể hiện trên ảnh điện di.
Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm plasmid pBT/GmDREB2 được cắt bằng XbaI và SacI; thang chuẩn 1 kb
2,705kb
0,48kb 3,0kb
Kết quả hình ảnh cho thấy xuất hiện 2 băng gọn, rõ nét ở vị trí đúng như tính toán lí thuyết, như vậy phản ứng cắt đã thành công. Với mục đích cắt lấy gen đích mang hai đầu dính khác nhau nên chúng tôi đã cắt băng có kích thước khoảng 480 bp để tinh sạch và bảo quản ở - 200C để dùng cho phản ứng tiếp sau.
3.2.2. Kết quả cắt plasmid pBI121 bằng XbaI và SacI
Thành phần của phản ứng cắt gồm: H2O: 19,5 μl; Buffer: 5 μl; XbaI: 2,5 μl; SacI: 3 μl; pBI121: 20 μl. Ủ ở 370C/16 giờ.
Plasmid pBI121 có kích thước 13,0kb; mang một vị trí cắt duy nhất của
XbaI và SacI ở hai đầu gen gus. Với việc xử lý bằng cùng một cặp enzym
XbaI và SacI plasmid pBI121 sẽ bị cắt mở vòng để loại bỏ gen gus, hình thành hai đầu tương ứng có liên kết bổ sung với hai đầu của gen GmDREB2. Theo lý thuyết thì sản phẩm cắt của pBI121 sẽ có hai băng tương ứng với kích thước khoảng 11,2 kb và 1,8 kb (kích thước của gen gus). Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.9. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pBI121 được cắt bằng XbaI và SacI; thang chuẩn 1kb
11,2 kb
Kết quả hình ảnh cho thấy đã xuất hiện hai đoạn băng đúng theo tính toán lý thuyết có kích thước khoảng 11,2 kb và 1,8 kb. Chúng tôi tiến hành cắt băng mong muốn tinh sạch, bảo quản ở nhiệt độ - 200C để phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển gen sau này.
3.2.3. Tạo vector chuyển gen pBI121 mang cấu trúc GmDREB2
Plasmid pBI121 là một dạng Ti-plasmid trong Agrobacterium tumefaciens đã được cải biến bằng cách loại bỏ gen gây độc và gắn vào gen kháng kháng sinh để chọn lọc phù hợp với việc chuyển gen vào tế bào thực vật. Chúng tôi sử dụng cùng một loại enzym là XbaI và SacI để xử lý cả hai cấu trúc là plasmid pBI121 và GmDREB2 nên chúng dễ dàng có thể được ghép nối lại với nhau nhờ enzym T4 ligase.
Thành phần của phản ứng ghép nối gồm: H2O: 2 μl; BufferT4: 1 μl; T4 ligase: 1 μl; GmDREB2: 4 μl; plasmid pBI121 : 2 μl. Phản ứng này được thực hiện ở 220C trong thời gian từ 3 giờ. Sau đó, chúng tôi tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp trên vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lượng lớn. Kết quả biến nạp vào
E. coli DH5α cho thấy có nhiều khuẩn lạc sống sót được trên môi trường có các kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l, chứng tỏ việc biến nạp trên đã thành công.
Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR
Để kiểm tra xem các khuẩn lạc có mang vector tái tổ hợp hay không, chúng tôi tiến hành chọn 3 khuẩn lạc riêng rẽ, tròn đều, từ đĩa khuẩn trên để tiến hành tách plasmid, sau đó thực hiện phản ứng PCR plasmid với mồi đặc hiệu. Kết quả colony- PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agrose 0,8% thể hiện ở hình 3.10. Qua hình ảnh cho thấy cả 3 mẫu plasmid tách chiết từ E. coli DH5α đã biến nạp vector tái tổ hợp pBI121/GmDREB2 đều cho kết quả dương tính, xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 480 bp. Như vậy
3 mẫu plasmid mang cấu trúc pBI121/GmDREB2 đều có thể sử dụng tốt cho thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.10. Hình điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc mang plasmid pBI121/GmDREB2 tái tổ hợp; Giếng 1-3: các dòng khuẩn lạc
mang plasmid pBI121/GmDREB2 tái tổ hợp; M: thang chuẩn 1 kb
Từ các khuẩn lạc đã được kiểm tra dương tính, chúng tôi tiến hành nuôi lỏng trên môi trường có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l, khuẩn được nuôi trên máy lắc 200 v/p ở nhiệt độ 370C trong thời gian 16 giờ. Sau đó, chúng tôi tiến hành tách plasmid bảo quản ở - 200C để sử dụng biến nạp tiếp vào A. tumefaciens làm công cụ chuyển gen.
3.3. KẾT QUẢ TẠO DÒNG VI KHUẨN A. tumefaciens MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2 TRÚC GEN GmDREB2
Sau khi thiết kế thành công plasmid pBI121/GmDREB2 chúng tôi tiến hành biến nạp vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Đây là phương pháp biến nạp cho hiệu quả cao, với thời gian thí nghiệm ngắn. Sản phẩm của quá trình biến nạp được nuôi phục hồi trong LB lỏng 1 giờ và cấy trải trên môi trường LB đặc có chứa 50 mg/l kanamycin và 50 mg/l rifamycin, ở 280C trong thời gian 48 giờ.
480 bp 500bp
Các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens được tạo ra nhờ xung điện 2,5 kV chứa Ti-plasmid tái tổ hợp đã được phát hiện bằng phương pháp chọn lọc trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc (kanamycin 50 mg/l và 50 mg/l rifamycin). Chỉ có những khuẩn lạc A. tumefaciens được biến nạp thành công plasmid pBI121/GmDREB2 mới sống được trên môi trường chọn lọc. Để tìm
A. Tumefacien mang gen quan tâm, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu. Chọn ngẫu nhiên 5 dòng khuẩn lạc A. tumefaciens mọc trên đĩa thạch để tiến hành phản ứng colony-PCR. Phản ứng được thực hiện với nhiệt độ gắn mồi 570C, lặp lại 30 chu kỳ. Sản phẩm phản ứng được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả thể hiện trong (Hình 3.11). Kết quả điện di cho thấy trong 5 dòng khuẩn lạc được kiểm tra đều lên 1 băng duy nhất có kích thước khoảng 480 bp. Với kết quả PCR đạt tỷ lệ 100%, có thể khẳng định chúng tôi đã biến nạp thành công vector pBI121/GmDREB2 vào vi khuẩn A. tumefaciens. Các chủng vi khuẩn 1, 2, 3, 4, 5 trên có thể phục vụ cho việc chuyển gen vào thực vật.
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid pBI121/GmDREB2; Giếng 1-5: các dòng vi
khuẩn mang plasmid pBI121/GmDREB2; M: thang chuẩn 1 kb
480 bp 500bp
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Đã nhân bản, tách dòng thành công và xác định được trình tự gen
GmDREB2 từ mRNA của giống đậu tương chịu hạn DT2008. Gen GmDREB2
có kích thước 480 bp, mã hoá 159 amino acid.
1.2. Phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc pBI121/GmDREB2.
1.3. Đã biến nạp thành công vector chuyển gen mang cấu trúc pBI121/GmDREB2 vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens và tạo được vi khuẩn tái tổ hợp phục vụ lây nhiễm để tạo cây chuyển gen.
2. Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu chuyển cấu trúc pBI121/GmDREB2 vào cây thuốc lá và cây đậu tương bằng phương pháp lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens
tái tổ hợp để tạo cây chuyển gen. Phân tích, đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng cây chuyển gen.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Giáo trình cao học Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi của cây lúa, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội. 3. Ngô Thế Dân (1999), Cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp.
4. Trịnh Đình Đạt (2006), Công nghệ sinh học tập 4 – Công nghệ di truyền, NXB Giáo dục.
5. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp Hà Nội.
6. Nguyễn Thị Thuý Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam, Luận án tiến sỹ Di truyền học, Đại học Thái Nguyên. 7. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh và sinh học
phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội. 8. Trần Thị Phương Liên (2010), Protein và tính chống chịu ở thực vật,
NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ.
9. Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp.
10. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2007), Công nghệ DNA tái tổ hợp, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh.
11. Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử, NXB Đại học Sư phạm.
12. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong chọn giống cây trồng, NXB Đại học Thái Nguyên.
13. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hường, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội.
14. Chu Hoàng Mậu, Nông Thị Man, Lê Trần Bình (2001), Đánh giá một số tính trạng kinh tế quan trọng và khả năng chịu hạn của các dòng đậu tương (Glycine max (L.) Merril) đột biến, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 1(13), Đại học Thái Nguyên, 16-21.
15. Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội.
16. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Đại học Sư phạm.
17. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền và phân lập một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh (Vigna radiate (L.) Wilczeck), Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội.
18. Phạm Văn Thiều (2008), Cây đậu Tương - Kỹ thuật trồng và chế biến sản phẩm, NXB Nông nghiệp.
Tài liệu tiếng Anh
19. Ahn J.H., Choi Y., Kim S.G., Kwon Y.M., Choi Y.D., Lee J.S. (1998), Expression of a Soybean Hydroxyproline-Rich Glycoprotein Gene Is Correlated with Maturation of Root, Plant Physiol, pp. 671 – 679.
20. Cortés AJ, This D, Chavarro C, Madriñán S, Blair MW (2012), Nucleotide e diversity patterns at the drought-related DREB2 encoding genes in wild and cultivated common bean (Phaseolus vulgaris L.), Theor Appl Genet, 125(5):1069-85.
21. Chen F., Chen S.Y. and Liu Q. (2002), Isolation of a rice cDNA encoding a DREB-like protein induced by stresses, NCBI, GenBank, Accession. AY064403.
22. Chen J, Xia X, Yin W. (2009), Expression profiling and functional characterization of a DREB2-type gene from Populus euphratica, College of Forestry, Beijing Forestry University, No. 35, Qinghua East Road, Beijing 100083, China.
23. Chen M., Wang Q.Y., Xu Z.S., Li L.C., Ye X.G., Xia L.Q, Ma Y.Z. (2007), GmDREB2, a soybean DRE – binding transcription factor, conferred droungt anh high – salt tolerance in transgenic plants, Biochem Biophys Res Commun, 353(2), pp. 299 – 305.
24. Chen Y., Chen P. and de los Reyes B.G. (2004), Analysis of the expression of DREB1 gene orthologs in cultivated and wild species of soybean, NCBI, Gen Bank, Accession. AY802779.
25. Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Parvez M.M., Seki M., Hiratsu K., Ohme-Takagi M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2005), AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis, Plant Cel, 17(12), pp.3470-88.
26. Hiroaki Fujii and Jian-Kang Zhu (2009), An auto phosphorylation site of the protein kinase SOS2 is important for salt telerance in Arabidopsis, Molecular Plant, doi: 10.1093/mp/ssn087.
27. Huang B., Jin L. and Liu J. (2007), Molecular cloning and functional characterization of a DREB1/CBF-like gene (GhDREB1L) from cotton, Sci. China, C, Life Sci. 50 (1), 7-14.
28. Kobayashi F, Ishibashi M, Takumi S. (2008), Transcriptional activation of Cor/Lea genes and increase in abiotic stress tolerance through expression of a wheat DREB2 homolog in transgenic tobacco, Laboratory of Plant Genetics, Graduate School of Agricultural Science, Kobe University, 1-1 Rokkodai-cho, Nada-ku, Kobe,657-8501, Japan. 29. Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zhang J.S., Chen S.Y. (2005),
Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses, Theor Appl Genet, 110(8), pp.1355-62.
30. Liu L, Zhu K, Yang Y, Wu J, Chen F, Yu D. (2008), Molecular cloning, expression profiling and trans-activation property studies of a DREB2- like gene from chrysanthemum (Dendranthema vestitum), National Center for Soybean Improvement, National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing, 210095, People’s Republic of China.
31. Liu W. and Feng F. (2008), Nicotiana tabacum DREB4 mRNA, complete cds, College of Life Science, Henan Agricultural University, Wenhua Road, Zhengzhou, Henan 450002, P.R. China.
32. Lucas S., Hammon N., Glavina del Rio T., Detter J., Dalin E., Tice H., Pitluck S., Tuskan G., Chapman J., Putnam N.H. (2009), Populus trichocarpa AP2/ERF domain-contanining transcription factor (DREB11), mRNA, US DOE Joint Genome Institute, 2800, Mitchell Drive B100, Walnut Creek, CA 94598-1698, USA.
33. Nakashima K, Shinwari ZK, Skuma Y, Seki M, Miura S, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. (2000), Organization and expression of two
Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involved in dehydration and high-salinity-responsive gene expression, Biological Resources Division, Japan International Research Center for Agricultural Sciences, Tsukuba, Ibaraki.
34. Nguyen H.T.T., Chu M.H., Le S.V., Nguyen C.H., Chu H.H. (2009), Glycine max mRNA for hypothetical protein (P5CS gene), isolate Song Ma-Son La (SL5), Accession FM999729.
35. Porcel R., Azcon R., Ruiz-Lozano J.M. (2005), Evaluation of the role of genes encoding for deltal-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) during drought stress in arbuscular mycorrhizal Qlycine max and Lactuca sativa plant, NCBI, Accession AJ715851.
36. Umezawa T, Yoshida R, Maruyama K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K and Thomashow MF (2004), SRK2C, a SNF1-Related protein kinase 2, improves drought tolerance by controlling stress- responsive gene expression in Arabidopsis thaliana, Proceeding of National Academy of Science, 101 (49): 17306-17311.
37. Xiaoshuang Li, Daoyuan Zhang, Haiyan Li, Yucheng Wang, Yuanming Zhang and Andrew J Wood (2014), EsDREB2B, a novel truncated DREB2-type transcription factor in the desert legume Eremosparton songoricum, enhances tolerance to multiple abiotic stresses in yeast and transgenic tobacco, BMC Plant Biology, 1471-2229.