3. Nội dung nghiên cứu
3.1.2.Tách dòng đoạn mã hoá (cDNA) của gen GmDREB2
Để thu đoạn mã hoá của gen GmDREB2 chúng tôi tiến hành cắt băng DNA mong muốn để tinh sạch. Quá trình tinh sạch được thực hiện theo quy trình và bộ hóa chất sử dụng của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit), kết quả thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch đoạn mã hoá của gen GmDREB2; M: thang chuẩn 1kb
Kết quả tinh sạch đoạn DNA ở hình 3.2 cho thấy băng DNA có kích thước khoảng 0,48 kb đúng với kích thước cuả gen GmDREB2, đủ độ sáng không lẫn tạp chất. Như vậy có thể kết luận là đã thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 0,48 kb, đảm bảo sử dụng tốt cho phản ứng tiếp theo.
Kết quả tạo vector tái tổ hợp
Để tạo được vector tái tổ hợp, chúng tôi thực hiện phản ứng ghép nối (ligation) đoạn gen GmDREB2 vào vector tách dòng pBT, đây là vector có nhiều ưu điểm (có kích thước nhỏ; có nhiều điểm cắt của enzyme giới hạn; có chứa gen kháng kháng sinh carbenicillin giúp cho quá trình chọn lọc đơn giản). Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen GmDREB2 vào vector pBT đã được mở vòng (Bảng 2.5), phản ứng được thực hiện trong ống eppendorf 0,5 ml sau đó để trong điều kiện 220C với thời gian 3 giờ, kết quả đã tạo ra được vector tái tổ hợp.
M GmDREB2
Kết quả tạo tế bào E.coli DH5α tái tổ hợp
Sau đó vector pBT sẽ được biến nạp vào tế bào E.coli DH5α và được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh carbenicillin là đồng phân của ampicillin, cơ chất X-gal, chất cảm ứng IPTG. Sau đó các tế bào này sẽ được nuôi ở 37oC trong 16 giờ. Khi này sẽ có các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng mọc được trên môi trường chọn lọc chứng tỏ chúng đều mang vector pBT. Trong đó khuẩn lạc xanh là các khuẩn lạc mang pBT tự đóng vòng nên chúng vẫn sinh tổng hợp nên protein GUS để phân giải cơ chất X-gal từ không màu thành màu xanh, còn các khuẩn lạc màu trắng do chúng mang vector pBT đã mất gen GUS nên không thể phân giải cơ chất thành màu xanh (Hình 3.3).
Hình 3.3. Ảnh đĩa khuẩn lạc
Tách dòng cDNA của gen GmDREB2
Để kiểm tra xem các dòng khuẩn lạc trắng này có mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn cDNA của GmDREB2, chúng tôi tiến hành phản ứng colony- PCR để sàng lọc, với cặp mồi đặc hiệu. Số lượng khuẩn lạc sau biến nạp rất lớn do đó chúng tôi tiến hành chọn ngẫu nhiên 13 khuẩn lạc trắng có kích thước đều nhau để thực hiện phản ứng colony- PCR. Sản phẩm colony-PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%; kết quả thấy xuất hiện băng DNA mong muốn có kích thước khoảng 0,48 kb, chứng tỏ rằng plasmid mang đoạn gen GmDREB2 (Hình 3.4). Các khuẩn lạc này được chọn dòng phục vụ cho việc đọc trình tự gen.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn cDNA của GmDREB2; giếng 1-13: các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn cDNA của GmDREB2; M:
thang chuẩn 1kb
Tiếp theo chúng tôi mang nuôi các khuẩn lạc đã được chọn lọc trong môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin ( tỉ lệ 1000LB: 1 carbenicillin). Nuôi ở 370C, lắc 200 vòng/phút, trong 16 giờ rồi mang tách plasmid. Sản phẩm tách plasmid được điện di kiểm tra trên gel agrose, kết quả được thể hiện trên hình 3.5.
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid pBT/GmDREB2 tái tổ hợp; Giếng 1-13: plasmid pBT/GmDREB2 của các dòng khuẩn lạc
Kết quả hình 3.5 cho thấy, đã tách thành công plasmid tái tổ hợp, đảm bảo đủ số lượng và chất lượng để phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
0,50 kb 0,48 kb