3. Nội dung nghiên cứu
1.3.2.Hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
Agrobacterium
Có hai hệ thống vector dùng cho chuyển gen thông qua A. tumefaciens
là hệ thống vector liên hợp và hệ thống vector nhị thể.
Vector liên hợp (cointegrate)
Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn. Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T – DNA lên một vector nhỏ hơn. Điều này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ. Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên kết. Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở dạng T – DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh). Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid
cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm cho việc sao chép bền vững của plasmid trong A. tumefaciens.
Vector liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng của một vector thông thường khác của E. coli, và thường gồm những phần sau:
i) Một vị trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI), thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli;
ii) Gen chỉ thị có tính kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli và A. tumefaciens;
iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật;
iv) Đoạn khởi đầu của E. coli, không hoạt động ở A. tumefaciens. Như vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai có chỗ cho GOI đi nhờ như một hành khách vào trong tế bào thực vật [1], [4], [10].
Vector nhị thể (binary vector)
Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA.
Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A. tumefaciens, loại vector nhị thể được thiết kế bao gồm các phần như sau:
i) Vị trí ghép nối đa điểm;
ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật.;
iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A. tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp;
v) Đoạn T – DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T – DNA.
Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật [1], [12], [16].
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU