3.6.1. Tách dòng gen cry4A và gen cry4B
3.6.1.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng
Vector pGEM-T Easy tồn tại ở dạng mạch thẳng với hai đầu tự do mỗi đầu thừa ra một nucleotide T nên dễ dàng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu so le A của sản phẩm PCR sử dụng Taq polymerase. Vì thế, chúng tôi lựa chọn vector pGEM-T Easy làm vector tách dòng. Các đoạn gen cry4A tính toán theo lý thuyết là 1035 bp và đoạn gen cry4B là 321 bp thu được từ phản ứng PCR của 3 chủng được gắn trực tiếp vào vector pGEM-T Easy bằng enzym T4 – ligase ở 40C. Sản phẩm là vector tái tổ hợp pGEM-T Easy –
cry4A – ĐNT 20.2, pGEM-T Easy – cry4A – 22.8, pGEM -T Easy – cry4B – ĐNT 5.4, pGEM-T Easy – cry4B – ĐNT 20.2.
3.6.1.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5α
Vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt, sau đó cấy trải trên môi trường LBA có bổ sung Ampicillin và Xgal nuôi ở 370
C. Sau 14 – 16 h thấy xuất hiện các khuẩn lạc xanh trắng trên đĩa petri (hình 3.7).
Các dòng vi khuẩn sinh trưởng được trên môi trường chứa kháng sinh Ampicillin chứng tỏ đã được biến nạp mang vector pGEM-T Easy có gen kháng kháng sinh.
Khuẩn lạc xanh xuất hiện là do promoter của lac - operon trên vector pGEM-T Easy vẫn hoạt động bình thường nên enzym ß- galactosidase vẫn được tổng hợp (vẫn có khả năng chuyển hóa X – gal từ không màu sang màu xanh), lúc này vector pGEM-T Easy tự đóng vòng.
Hình 3.7. Hình ảnh khuẩn lạc xanh – trắng trên môi trƣờng LBA 1. khuẩn lạc xanh
2. khuẩn lạc trắng
Khuẩn lạc trắng xuất hiện là do hai nguyên nhân sau:
+ Nguyên nhân thứ nhất có thể là do tế bào vi khuẩn nhận được vector tái tổ hợp mang đoạn DNA chèn vào giữa vùng lac- operon và gen cấu trúc
lacz làm hỏng promoter của gen lac- operon trong vector pGEM-T Easy nên trong quá trình sinh trưởng không tạo ra enzym ß- galactosidase, không có khả năng chuyển hoá được cơ chất x- gal có trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn vì vậy mà không có màu xanh.
+ Nguyên nhân thứ hai có thể là do promoter điều khiển hoạt động của gen mã hoá cho enzym ß - galactosidase bị hỏng, dẫn đến không tạo ra được enzym ß- galactosidase do đó mà vi khuẩn E. coli không chuyển hoá được X- gal có trong môi trường nên tạo thành các khuẩn lạc màu trắng.
Do có tới hai khả năng dẫn đến việc khuẩn lạc có màu trắng mà chúng tôi phải tiến hành tách plasmide để kiểm tra xem khuẩn lạc trắng nào trong
1 2
đĩa thạch được biến nạp và nhận được vector tách dòng tái tổ hợp mang gen quan tâm.
Chúng tôi tiến hành lấy các khuẩn lạc trắng và một khuẩn lạc xanh của từng chủng lần lượt cấy vào các lọ penicillin mỗi lọ chứa 2 ml môi trường LB bổ sung Amp (nồng độ 50 µg/ml) nuôi lắc ở 370
C qua đêm để tiến hành tách chiết plasmid. Phương pháp tách chiết plasmid đã được mô tả ở phần 2.2.9.3 trong phần vật liệu và phương pháp.
3.6.1.3 Kiểm tra sự có mặt của gen cry4A, cry4B trong các dòng plasmid tái tổ hợp
Do trên vectơ tách dòng pGEM – T Easy có chứa vị trí cắt của enzym EcoRI tiếp giáp với vùng đa cắt nối (vùng cho phép cài gắn các đoạn gen cần tách dòng) nên chúng tôi sử dụng enzym EcoRI để kiểm tra và đảm bảo quá trình tách dòng đã thực hiện thành công với vectơ tái tổ hợp pGEM – T Easy-cry4A và pGEM – T Easy-cry4B . Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả được thể hiện tại hình 3.8 và hình 3.9.
Hình 3.8. Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm cắt DNA plasmid các dòng khuẩn lạc biến nạp gen cry4A trên gel agarose 0,8 %
Giếng 1,2: Sản phẩm cắt các dòng pGEM – T Easy – cry4A – ĐNT22.8 Giếng 3,4: Sản phẩm cắt các dòng pGEM – T Easy – cry4A - ĐNT20.2 Giếng 5: sản phẩm PCR từ chủng ĐNT20.2 (đối chứng) 1 2 3 4 5 3000 1000 3015 1035 bp bp
Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmid trên gel agarose 0,8 % Giếng 1: pGEM – T Easy – ĐNT5.4
Giếng 2: pGEM – T Easy – ĐNT20.2
Giếng 3: sản phẩm PCR từ chủng ĐNT20.2 (đối chứng)
Kết quả cho thấy, plasmid của các dòng khuẩn lạc plasmid tái tổ hợp gen cry4A của các chủng ĐNT20.2 và ĐNT22.8 sau khi cắt bằng enzym
EcoRI tạo ra hai băng, băng lớn là vectơ tách dòng pGEM – T Easy có kích thước 3015 bp và băng nhỏ đều xuất hiện băng có kích thước 1035 bp. Các dòng khuẩn lạc tái tổ hợp mang gen cry4B của các chủng ĐNT5.4 và ĐNT20.2 sau khi cắt bằng enzym EcoRI tạo ra hai băng, băng lớn là vectơ tách dòng pGEM – T Easy có kích thước 3015 bp và băng nhỏ có kích thước khoảng 321 bp tương ứng với sản phẩm PCR của gen cry4B. Điều này chứng tỏ các plasmid tái tổ hợp pGEM – T Easy-cry4A-ĐNT20.2 và pGEM – T easy-cry4A-ĐNT22.8 mang gen cry4A. Các plasmid pGEM – T Easy-cry4B- ĐNT5.4 và pGEM – T easy-cry4B-ĐNT20.2 có mang đoạn gen cry4B.
Để có thể kết luận chính xác hơn về plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen cry4A và cry4B hay không chúng tôi tiến hành chạy PCR với khuôn DNA là các plasmid tái tổ hợp trên.
321 bp 3015 bp
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và kết quả chỉ có một băng DNA kích thước khoảng 321 bp giống với sản phẩm PCR của gen cry4B ở phần 3.1.5. Kết quả được thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10. Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen
cry4A và cry4B từ các dòng plasmid tái tổ hợp:
1, 2: sản phẩm PCR của các plasmid tái tổ hợp pGEM – T Easy-cry4A- ĐNT20.2 và pGEM – T easy-cry4A-ĐNT22.8
3,4: sản phẩm PCR của các plasmid tái tổ hợp pGEM – T Easy-cry4B- ĐNT20.2 và pGEM – T easy-cry4B-ĐNT55.4
Từ những kết quả ở trên bước đầu có thể kết luận là đã tách dòng thành công gen cry4A cry4B trong vectơ pGEM – T Easy. Tuy nhiên, để kiểm tra chính xác gen tách dòng có đúng là gen cry4A và cry4B hay không chúng tôi tiến hành đọc trình tự các đoạn gen này và so sánh với các trình tự gen đã công bố trong Ngân hàng Gen Quốc tế bằng phần mềm chuyên dụng.
3.6.1.4 Xác định trình tự đoạn gen
Sau khi thu nhận được các plasmid chứa đoạn gen cry4B chúng tôi tiến hành đọc trình tự đoạn gen này theo phương pháp của Sanger và cộng sự bằng máy đọc trình tự DNA tự động. Trình tự gen của hai chủng này tiếp tục được so sánh trên Ngân hàng Gen Quốc tế theo phần mềm Blast và BioEdit.
1 2 3 4 5
1035
321 bp
* Xác định trình tự đoạn gen Cry4A
Bảng 3.4. So sánh trình tự ĐNT20.2-4A5 với các trình tự đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm Blast
Accession Description Max
score Total score Query coverage E value Max ident
Y00423.1 Bacillus thuringiensis gene for 130 kDa delta-
endotoxin 1901 1901 100% 0.0 99%
D00248.1
Bacillus thuringiensis israelensis plasmid gene for 130 kDa insecticidal protein (ISRH4), complete cds
1901 1901 100% 0.0 99%
EF424470.1 Bacillus thuringiensis isolate DAB-BT6 Cry4A
gene, complete cds 1879 1879 100% 0.0 99%
EF208904.1 Bacillus thuringiensis Cry4A (cry4A) gene,
complete cds 1879 1879 100% 0.0 99%
EF424472 Bacillus thuringiensis isolate DAB-BT4 Cry4A
gene, complete cds 1873 1873 100% 0.0 99%
EF424468.1 Bacillus thuringiensis isolate DAB-BT3 Cry4A
gene, complete cds 1862 1862 100% 0.0 99%
EF424471.1 Bacillus thuringiensis isolate DAB-BT2 Cry4A
gene, complete cds 1857 1857 100% 0.0 99%
EF424469.1 Bacillus thuringiensis isolate DAB-BT5 Cry4A
gene, complete cds 1857 1857 100% 0.0 99%
DQ174290.1Bacillus thuringiensis Cry4A (cry4a) gene,
partial cds 1814 1814 100% 0.0 98%
10 20 30 40 50 60 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT20.2-4A CGAGGTGAAA TTTGCTCCAA ATCAAAACAT ATCTCTTGTG TTTAATCGTT CGGATGTATA
ĐNT22.8-4A CGAGGTGAAA TTTGCTCCAA ATCAAAACAT ATCTCTTGTG TTTAATCGTT CGGATGTATA
EF424472 CGAGGTGAAA TTTGCTCCAA ATCAAAACAT ATCTCTTGTG TTTAATCGTT CGGATGTATA
70 80 90 100 110 120 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT20.2-4A TACAAACACA ACAGTACTTA TTGATAAAAT TGAATTTCTG CCAATTACTC GTTCTATAAG
ĐNT22.8-4A TACAAACACA ACAGTACTTA TTGATAAAAT TGAATTTCTG CCAATTACTC GTTCTATAAG
130 140 150 160 170 180 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT20.2-4A AGAGGATAGT AGAGAAACAA AAATTAGAAA CAGTACAACA AATAATTAAT ACATTTTATG
ĐNT22.8-4A AGAGGATAG- AGAGAAACAA AAATTAGAAA CAGTACAACA AATAATTAAT ACATTTTATG
EF424472 AGAGGATAG- AGAGAAACAA AAATTAGAAA CAGTACAACA AATAATTAAT ACATTTTATG
190 200 210 220 230 240 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT20.2-4A CAAATCCTAT AAAAAACACT TTACAATCAG AACTTACAGA TTATGACATA GATCAAGCCG
ĐNT22.8-4A CAAATCCTAT AAAAAACACT TTACAATCAG AACTTACAGA TTATGACATA GATCAAGCCG
EF424472 CAAATCCTAT AAAAAACACT TTACAATCAG AACTTACAGA TTATGACATA GATCAAGCCG
250 260 270 280 290 300 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT20.2-4A CAAATCTTGT GGAATGTATT TCTGAAGAAT TATATCCAAA AGAAAAAATG CTGTTATTAG
ĐNT22.8-4A CAAATCTTGT GGAATGTATT TCTGAAGAAT TATATCCAAA AGAAAAAATG CTGTTATTAG
EF424472 CAAATCTTGT GGAATGTATT TCTGAAGAAT TATATCCAAA AGAAAAAATG CTGTTATTAG
310 320 330 340 350 360 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT20.2-4A ATGAAGTTAA AAATGCGAAA CAACTTAGTC AATCTCGAAA TGTACTTCAA AACGGGGATT
ĐNT22.8-4A ATGAAGTTAA AAATGCGAAA CAACTTAGTA AATCTCGAAA TGTACTTCAA AACGGGGATT
EF424472 ATGAAGTTAA AAATGCGAAA CAACTTAGTA AATCTCGAAA TGTACTTCAA AACGGGGATT
370 380 390 400 410 420 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT20.2-4A TTGAATCGGC TACGCTTGGT TGGACAACAA GTGATAATAT CACAATTCAA GAAGATGATC ĐNT22.8-4A TTGAACCGGC TACGCTTGGT TGGACAACAA GTGATAATAT CACAATTCAA GAAGATGATC EF424472 TTGAACCGGC TACGCTTGGT TGGACAACAA GTGATAATAT CACAATTCAA GAAGATGATC 430 440 450 460 470 480 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT20.2-4A CTATTTTTAA AGGGCATTAC CTTCATATGT CTGGGGCGAG AGACATTGAT GGTACGATAT ĐNT22.8-4A CTATTTTTAA AGGGCATTAC CTTCATATGT CTGGGGCGAG AGACATTGAT GGTACGATAT EF424472 CTATTTTTAA AGGGCATTAC CTTCATATGT CTGGGGCGAG AGACATTGAT GGTACGATAT 490 500 510 520 530 540 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT20.2-4A TTCCGACCTA TATATTCCAA AAAATTGATG AATCAAAATT AAAACCGTAT ACACGTTACC
ĐNT22.8-4A TTCCGACCTA TATATTCCAA AAAATTGATG AATCAAAATT AAAACCGTAT ACACGTTACC
EF424472 TTCCGACCTA TATATTCCAA AAAATTGATG AATCAAAATT AAAACCGTAT ACACGTTACC
550 560 570 580 590 600 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT20.2-4A TAGTAAGGGG ATTTGTAGGA AGTAGTAAAG ATGTAGAACT AGTGGTTTCA CGCTATGGGG ĐNT22.8-4A TAGTAAGGGG ATTTGTAGGA AGTAGTAAAG ATGTAGAACT AGTGGTTTCA CGCTATGGGG EF424472 TAGTAAGGGG ATTTGTAGGA AGTAGTAAAG ATGTAGAACT AGTGGTTTCA CGCTATGGGG 610 620 630 640 650 660 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT22.8-4A AAGAAATTGA TGCCATCATG AATGTTCCAG CTGATTTAAA CTATCTGTAT CCTTCTACCT
EF424472 AAGAAATTGA TGCCATCATG CATGTTCCAG CTGATTTAAA CTATCTGTAT CCTTCTACCT
670 680 690 700 710 720 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT20.2-4A GTGATTGTGA AGCGTCTAAT CGTTGTGAGA CGTCCGCTGT GCCGGCTAAC ATTGGGAACA ĐNT22.8-4A TTGATTGTGA AGGGTCTAAT CGTTGTGAGA CGTCCGCTGT GCCGGCTAAC ATTGGGAACA EF424472 GTGATTGTGA AGCGTCTAAT CGTTGTGAGA CGTCCGCTGT GCCGGCTAAC ATTGGGAACA 730 740 750 760 770 780 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT20.2-4A CTTCTGATAT GTTGTATTCA TGCCAATATG ATACAGGGAA AAAGCATGTC GTATGTCAGG ĐNT22.8-4A CTTCTGATAT GTTGTATTCA TGCCAATATG ATACAGGGAA AAAGCATGTC GTATGTCAGG EF424472 CTTCTGATAT GTTGTATTCA TGCCAATATG ATACAGGGAA AAAGCATGTC GTATGTCAGG 790 800 810 820 830 840 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT20.2-4A ATTCCCATCA ATTTAGTTTC ACTATTGATA CAGGGGCATT AGATACAAAT GAAAATATAG
ĐNT22.8-4A ATTCCCATCA ATTTAGTTTC ACTATTGATA CAGGGGCATT AGATACAAAT GAAAATATAG
EF424472 ATTCCCATCA ATTTAGTTTC ACTATTGATA CAGGGGCATT AGATACAAAT GAAAATATAG
850 860 870 880 890 900 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT20.2-4A GGGTTTGGGT CATGTTTAAA ATATCTTCTC CAGATGGATA CGCATCATTA GATAATTTAG ĐNT22.8-4A GGGTTTGGGT CATGTTTAAA ATATCTTCTC CAGATGGATA CGCATCATTA GATAATTTAG EF424472 GGGTTTGGGT CATGTTTAAA ATATCTTCTC CAGATGGATA CGCATCATTA GATAATTTAG 910 920 930 940 950 960 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT20.2-4A AAGTAATTGA AGAAGGGCCA ATAGATGGGG AAGCACTGTC ACGCGTGAAA CACATGGAGA ĐNT22.8-4A AAGTAATTGA AGAAGGGCCA ATAGATGGGG AAGCACTGTC ACGCGTGAAA CACATGGAGA EF424472 AAGTAATTGA AGAAGGGCCA ATAGATGGGG AAGCACTGTC ACGCGTGAAA CACATGGAGA 970 980 990 1000 1010 1020 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT20.2-4A AGAAATGGAA CGATCAAATG GAAGCAAAAC GTTCGGAAAC ACAACAAGCA TATGATGTAG
ĐNT22.8-4A AGAAATGGAA CGATCAAATG GAAGCAAAAC GTTCGGAAAC ACAACAAGCA TATGATGTAG
EF424472 AGAAATGGAA CGATCAAATG GAAGCAAAAC GTTCGGAAAC ACAACAAGCA TATGATGTAG
1030 ....|....| ...
ĐNT20.2-4A CGAAACAAGC CAT
ĐNT22.8-4A CGAAACAAGC CAT
EF424472 CGAAACAAGC CAT
Hình 3.11. Kết quả so sánh trình tự gen cry4A
Kết quả cho thấy đây là đoạn đặc hiệu cho gen cry4A mã hóa cho protein Cry4A của vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israenlensis. Đoạn gen có độ tương đồng 99% so với trình tự có số đăng ký EF424472 trong đó
plasmid ĐNT20.2 – 4A có 3 vị trí thay đổi: 130: thêm một nucleotide (T), 330 (C → A), 366: (T → C), Và plasmid ĐNT22.8 có 3 vị trí thay đổi là 621: (A → C), 661: (T → G), 673: (G → C).
* Trình tự gen cry4B
Tương tự đối với gen cry4B, đoạn gen được đọc trình tự có kích thước 321 nucleotide. Trình tự này đã được kiểm tra, phân tích và so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm Bioedit, Blast. Kết quả như sau:
Bảng 3.5. So sánh trình tự ĐNT5.4-4B1 với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm Blast
Accession Description Max
score Total score Query coverage E value Max ident EF468625.1
Bacillus thuringiensis isolate DAB-Bt1 pesticidal crystal protein gene, complete cds
577 577 100% 1e-161 99%
AY847707.1
Bacillus thuringiensis strain PBT602 130 kDa crystal protein (cry) gene, complete cds
577 577 100% 1e-161 99%
X07423.1
Bacillus thuringiensis israelensis bt8 gene for 130 kDa crystal protein (mosquito- specific toxin)
577 577 100% 1e-161 99%
X07082.1 Bacillus thuringiensis gene for 130 kDa
delta-endotoxin 577 577 100% 1e-161 99%
AL731825.1Bacillus thuringiensis subsp. israelensis
plasmid pBtoxis 577 674 100% 1e-161 99%
D00247.1
Bacillus thuringiensis israelensis plasmid gene for 130 kDa insecticidal protein (ISRH3), complete cds
577 577 100% 1e-161 99%
AY729887.1
Bacillus thuringiensis serovar israelensis delta-endotoxin (cry4BLB) gene, complete cds
571 571 100% 6e-160 98%
Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident
pesticidal crystal protein gene, complete cds
EF468627.1
Bacillus thuringiensis isolate DAB-Bt3 pesticidal crystal protein gene, complete cds
566 566 100% 3e-158 98%
EF468626.1
Bacillus thuringiensis isolate DAB-Bt2 truncated pesticidal crystal protein gene, complete cds
566 566 100% 3e-158 98%
M20242.1 B.thuringiensis mosquitocidal protein
(CryD2) gene, complete cds 560 560 99% 1e-156 98%
EF468630.1
Bacillus thuringiensis isolate DAB-Bt6 pesticidal crystal protein gene, complete cds
555 555 100% 6e-155 97%
EF468629.1
Bacillus thuringiensis isolate DAB-Bt5 pesticidal crystal protein gene, complete cds
555 555 100% 6e-155 97%
EF182769.1
Bacillus thuringiensis serovar
israelensis/tochigiensis cry4B gene, partial cds
507 507 88% 2e-140 98%
DQ910833.1Mutant Bacillus thuringiensis Cry4B
(cry4B) gene, partial cds 505 505 89% 6e-140 98%
DQ078743.1
Bacillus thuringiensis strain LDC-9 pesticidal crystal protein cry4B-like (cry4B) gene, complete cds
420 420 81% 2e-114 95% 10 20 30 40 50 60 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT5.4-4B CGTTTTCAAG ACCTAATAAT ATAATACCTA CAGATTTAAA ATATGAAGAG TTTAGATACA ĐNT20.2-4B CGTTTTCAAG ACCTAATAAT ATAATACCTA CAGATTTAAA ATATGAAGAG TTTAGATACA AY729887.1 CGTTTTCAAG ACCTAATAAT ATAATACCTA CAGATTTAAA ATATGAAGAG TTTAGATACA 70 80 90 100 110 120 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT5.4-4B AAGATCCTTT TGATGCAATT GTACCGATGA GATTATCTTC TAATCAACTG ATAACTATAG ĐNT20.2-4B AAGATCCTTT TGATGCAATT GTACCGATGA GATTATCTTC TAATCAACTG ATAACTATAG AY729887.1 AAGATCCTTT TGATGCAATT GTACCGATGA GATTATCTTC TAATCAACTG ATAACTATAG 130 140 150 160 170 180
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT5.4-4B CTATTCAACC ATTAAACATG ACTTCAAATA ATCAAGTGAT TATTGACAGA ATCGAAATTA
ĐNT20.2-4B CTATTCAACC ATCAAACATG ACTTCAAATA ATCAAGTGAT TATTGACAGA ATCGAAATTA
AY729887.1 CTATTCAACC ATCAAACATG ACTTCAAATA ATCAAGTGAT TATTGACAGA ATCGAAATTA
190 200 210 220 230 240 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT5.4-4B TTCCAATCAC TCAATCTGTA TTAGATGAGA CAGAGAACCA AAATTTAGAA TCAGAACGAG ĐNT20.2-4B TTCCAATCAC TCAATCTGTA TTAGATGAGA CAGAGAACCA AAATTTAGAA TCAGAACGAG AY729887.1 TTCCAATCAC TCAATCTGTA TTAGATGAGA CAGAGAACCA AAATTTAGAA TCAGAACGAG 250 260 270 280 290 300 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT5.4-4B AAGTTGTGAA TGCACAGTTA ACAAAAGACG CGAAAGATGC ATTAAACATT GGAACGACAG
ĐNT20.2-4B AAGTTGTGAA TGCACTGTTT ACAAATGACG CGAAAGATGC ATTAAACATT GGAACGACAG
AY729887.1 AAGTTGTGAA TGCACTGTTT ACAAATGACG CGAAAGATGC ATTAAACATT GGAACGACAG
310 320 ....|....| ....|....| .
ĐNT5.4-4B ATTATGACAT AGATCAAGCC G
ĐNT20.2-4B ATTATGACAT AGATCAAGCC G
AY729887.1 ATTATGACAT AGATCAAGCC G
Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự gen cry4B
Trình tự đoạn đặc hiệu của gen cry4B cho thấy đây là đoạn đặc hiệu gen cry4B mã hóa cho protein Cry4B của vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Đoạn gen của chủng ĐNT 5.4 có độ tương đồng 98% so với trình tự có số đăng ký AY729887.1, trong đó đoạn gen có 3 vị trí thay đổi: 133 (T → C), 256 (A → T), 266 (A → T). Trong khi đó, đoạn gen cry4B của chủng ĐNT20.2 có độ tương đồng 100% với trình tự so sánh.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. 31 mẫu đất thu thập từ các vùng khác nhau của Nha Trang đã phân lập được 383 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Trong đó, đã xác định được 185 chủng Bacillus thuringiensis có khả năng hình thành tinh thể với c hỉ số