- Các chủng vi khuẩn B. thuringiensis phân lập tại đất Nha Trang, các chủng dưới loài Bti do phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
- Ấu trùng muỗi: Anopheles minimus, Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus do Viện Sốt rét Ký sinh trùng và Côn trùng TW cung cấp.
Mồi sử dụng để khuyếch đại và đọc trình tự gen cry 4A, cry 4B có trình tự như sau: Cặp mồi Trình tự Gen Kích thƣớc (kb)
cry4A3 5’-CGA GGT GAA ATT TGC TCC-3´ cry4A
1,0 cry4A5 5´-ATG GCT TGT TTC GCT ACA TC-3´ cry4A
cry4BF 5’-CGTTTTCAAGACCTAATAATATAATAC-3’ cry4B 0,3 cry4BR 5’-CGGCTTGATCTATGTCATAATCTG T-3’ cry4B
Quick Gel Extraction Kit: PureLink (Invitrogen).
2.1.2. Hoá chất và môi trƣờng a. Hoá chất, dung dịch
Các hoá chất dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử được mua từ các hãng Sigma, Merk, Invitrogen, Bio-Rad, bao gồm: dNTP, Taq polymerase, agarose, marker, ethidium bromide, protease, RNAse, axit axetic, enzyme,
Các hoá chất dùng cho nghiên cứu vi sinh vật bao gồm: cao nấm men, cao thịt, trypton, agar, glucose, NaCl…
Dung dịch tách chiết DNA plasmid:
Dung dịch Sol I: Tris – HCl 1M; pH8 2,0 ml EDTA 0,5M; pH8 1,6 ml Glucose 0,72g H2O khử ion tới 80 ml
Dung dịch Sol II: NaOH 3M 100 l SDS 10% 150 l H2O khử ion 1250 l
Dung dịch Sol III: CH3COOK 3M 23,52 g CH3COOH 9,2ml
Dung dịch TAE 50X: Tris base 121 g EDTA 0,5M; PH8 50 l CH3COOH 28,6 l H2O khử ion tới 50 ml
Dung dịch TAE 1X: Dung dịch TAE 50X 10ml Nước cất 490ml
Loading Dye Bromophenol Blue 1% 1 ml Glycerol 87% 3,45 ml H20 khử ion 5,55 ml RNAse 10 mg/ ml Tris (0,1M; pH 7,5) 0,15 ml NaOH 1M 0,022 ml H2O khử ion 1,328 ml EDTA (0,5 M; pH 8) EDTA 14,61 g H2O khử ion 100 ml Chỉnh pH bằng NaOH
b. Môi trường
1. Môi trường MPA:
Cao thịt: 3 g NaCl: 5 g Peptone: 10 g H2O: 1 lít Agar: 20 g pH: 7-7,2 2. Môi trường lỏng MPB: Cao thịt: 3 g H2O: 1 lít Peptone: 10 g pH: 7-7,2 NaCl: 5 g
3. Môi trường Craige
Cao thịt: 3 g NaCl: 5 g Peptone: 10 g H2O: 1 lít Bacto agar: 8 g pH: 7-7,2 4. Môi trường LB lỏng Yeast extract: 5 g H2O: 1 lít NaCl : 10 g pH: 7-7,2 Trypton : 10 g 2.1.3.Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm Dụng cụ
Effendoft, pipet, đầu côn, ống fancol, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, giấy bạc, nhiệt kế, ...
Tên thiết bị Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất
Box cấy Esco Singapo
Tủ ấm OSI Pháp
Máy lắc ổn nhiệt Gerharat Liên Xô cũ
Máy ly tâm lạnh Fresco Đức
Máy vortex IKA Đức
Kính hiển vi quang học Olympus Nhật
Tủ lạnh sâu Frigo Đan mạch
Máy điện di Amersham Pharmacia Biotech Thụy Điển
Máy PCR PTC – 100 Mỹ
Máy đo pH Thermo Mỹ
Máy khuấy từ Velp Europe
Máy soi chụp ảnh Gel BioRad Mỹ
Bể ổn nhiệt Memmert Đức
Tủ sấy khô Modulyo Anh
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Các mẫu đất được thu thập bằng cách dùng dao vô trùng cạo bề mặt đất và lấy 50g ở độ sâu 3-5cm, cho vào túi nilon dán kín. Đối với mẫu lá, dùng dao vô trùng cắt 3-5 lá ở các vị trí khác nhau trên cây cho vào túi nilon dán kín. Các mẫu sau khi lấy được bảo quản ở 4 oC cho đến khi sử dụng.
Các mẫu lá được cắt thành từng mảnh nhỏ, cho vào cối sạch nghiền nát, dịch này cho vào eppendorf đun cách thuỷ ở 70 oC trong 30 phút. Dịch đã xử lý pha loãng với nước cất vô trùng ở các nồng độ 10-2
, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Hút 100l dịch pha loãng trang lên đĩa Petri chứa môi trường MPA. Ở mỗi nồng độ pha loãng cấy 3 đĩa nuôi trong 72 giờ ở 28 o
Với mẫu đất, cân 1g đất cho vào bình tam giác 100ml chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc ở 200 vòng/phút trong 10 phút. Lấy dịch ra làm tương tự như mẫu lá.
Xác côn trùng được rửa qua bằng cồn 700, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng, tiến hành phân lập như đối với mẫu lá và mẫu đất.
Sau 72 giờ nuôi cấy chọn những khuẩn lạc riêng rẽ mọc trên môi trường và làm tiêu bản. Quan sát hình thái tế bào, bào tử, tinh thể trên kính hiển vi đối pha, hoặc nhuộm với thuốc nhuộm tinh thể, quan sát ở vật kính dầu. Lựa chọn những khuẩn lạc của vi khuẩn Bt sinh tinh thể, sau đó được cấy và quan sát lại. Tiến hành cấy thảm trên toàn bộ mặt thạch đối với các khuẩn lạc này, ủ ở 28 oC sau 72 giờ, rửa mặt thạch bằng 2 ml nước muối sinh lý, thu dịch rửa vào eppendorf vô trùng để bảo quản.
Chỉ số Bt là số khuẩn lạc Bt/Tổng số khuẩn lạc kiểm tra. Tần suất xuất hiện Bt là số mẫu đất có Bt/tổng số mẫu đất.
2.2.2. Phƣơng pháp xác định nồng độ bào tử
Chủng Bt phân lập được được đem cấy thảm trên đĩa peptri chứa môi trường MPA và nuôi trong tủ ấm 280
C trong 3-4 ngày rồi đem thu sinh khối vào ống eppendorf. Lấy 200l dịch sinh khối này chuyển sang 1 ống eppendorf khác rồi đem đi xử lý nhiệt ở 800C trong 10 phút để loại bỏ tế bào sinh dưỡng. Sau đó đem pha loãng đến nồng độ giảm dần theo thang bậc 10 liên tiếp đến khi có độ pha loãng với mật độ bào tử thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm, hút 100l dịch pha loãng ở mỗi nồng độ trang vào 3 đĩa peptri chứa môi trường MPA. Nuôi trong tủ ấm 280C sau 24 giờ đem đếm số khuẩn lạc mọc trên từng đĩa ở mỗi nồng độ.
Số khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 25-250 khuẩn lạc/đĩa.
Kết quả được tính toán theo đơn vị hình thành khuẩn lạc( CFU/ml)
Tính kết quả:
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng theo công thức:
A = i i i nvf vf n N ... 1 (CFU/ml) Trong đó: A: Số bào tử
N: Tổng số khuẩn lạc trên đĩa thuộc ngưỡng 25-250
V: Thể tích dịch sinh khối (ml cấy vào trong mỗi nồng độ) fi: độ pha loãng tương ứng[50].
2.2.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học
Ấu trùng muỗi thử nghiệm: Culex quinquefasciatus.
Hút vào mỗi cốc đã được lau sạch bằng cồn 99ml H2O cất và 10 ấu trùng muỗi tuổi 3/cốc và cho một ít thức ăn để nuôi ấu trùng.
Pha loãng các chủng Bt phân lập được ở các nồng độ 108
và 106 bào tử/ml cho vào mỗi cốc thử nghiệm. Mỗi chủng ở mỗi nồng độ sẽ làm 3 cốc để có độ tin cậy.
Để mẫu thí nghiệm ở nhiệt độ 200
-250C và đặt ở nơi thoáng mát tránh ánh nắng, theo dõi tỉ lệ ấu trùng muỗi chết sau 6, 12, 18, 24 giờ.
Đối chứng: Dùng cốc chứa 100ml H2O cất và 10 con ấu trùng muỗi mỗi cốc. Làm 3 mẫu đối chứng cho mỗi loại muỗi. Theo dõi các thời gian như bình thường.
Tỉ lệ ấu trùng muỗi chết tính theo công thức Abbott: A = (C - T)/C.100
A: % ấu trùng muỗi chết
C: Số ấu trùng muỗi còn sống ở mẫu đối chứng
2.2.4. Kỹ thuật định typ huyết thanh
Bộ huyết thanh miễn dịch chuẩn được thu nhận từ cấc chủng Bt chuẩn theo phương pháp của de Barjac và Bonnefoi, 1962.
Cấy các chủng Bacillus thuringiensis đã phân lập vào trong các ống nghiệm craige (một ống thủy tinh nhỏ cắm thẳng đứng vào môi trường MT1 chứa trong ống nghiệm to). Nuôi trong tủ ấm 280C sau 18 đến 24 giờ rồi chọn những ống craige chứa những tế bào vi khuẩn có khả năng chuyển động tốt đã chuyển động lên bề mặt phần môi trường MT1 ở giữa 2 ống. Cấy chuyển những tế bào này vào ống craige một lần nữa. Khi vi khuẩn phát triển trên ống Craige với thời gian chuyển động là 16-18 giờ thì cấy được vào ống nghiệm chứa 2- 3ml môi trường MPB rồi nuôi cấy lắc ở 70 vòng/phút từ 8-12 giờ.
Lấy 1l dịch nuôi nhỏ lên phiến kính lõm, quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trên kính hiển vi. Nếu vi khuẩn chuyển động tốt, nhỏ tiếp 1l huyết thanh chuẩn và quan sát sự ngưng kết của vi khuẩn. Thử lần lượt với các typ huyết thanh khác, ghi lại huyết thanh gây ra hiện tượng ngưng kết tức là khả năng làm cho vi khuẩn mất khả năng chuyển động hoàn toàn [3, 9,11].
2.2.5. Khuếch đại gen mã hóa độc tố bằng phản ứng PCR
Các chủng Bt phân lập sau khi định typ huyết thanh và có hiệu quả diệt muỗi cao được cấy được vào ống nghiệm có chứa 1,5 ml môi trường MPB, nuôi lắc ở 220 vòng/phút, trong 12 giờ ở nhiệt độ 280
C. Sau đó, đổ dịch nuôi cấy vào eppendorf ly tâm 6000 vòng trong 10 phút, thu cặn, rửa lại bằng nước cất khử ion đã khử trùng. Sau đó, hòa tan lại bằng 70l nước cất khử ion và xử lý mẫu ở 1000
C trong 10 phút. Li tâm nhanh, thu dịch nổi làm khuôn cho phản ứng PCR.
Thành phần phản ứng PCR cho một chủng và một cặp mồi: Thành phần của phản ứng PCR (30 μl):
dNTPs (100 mM) 2 μl MgCl2 4,8 μl Mồi xuôi (10 pM) 1 μl Mồi ngược (10 pM) 1 μl DNA khuôn 1 μl Taq polymeraza 5U 1 μl H2O khử ion vô trùng 17,2 μl
a. Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen cry4A:
1. Biến tính ban đầu ở nhiệt độ 940C trong 3 phút. ADN khuôn được biến tính. Mục đích là để phá vỡ các liên kết hydro giữa hai mạch đơn và để hai mạch đơn tách nhau ra.
2. Phản ứng tiếp diễn theo chu kì, 30 chu kì, mỗi chu kì có các bước sau:
Biến tính ở nhiệt độ 940C trong khoảng thời gian là 1 phút.
Gắn mồi ở nhiệt độ 560C, thời gian là 1 phút. Đoạn mồi gắn vào ADN khuôn sợi đơn theo nguyên tắc bổ sung giữa các bazơ nitơ.
Tổng hợp ADN ở nhiệt độ 720
trong thời gian 1 phút. Enzyme Taq ADN polymeraza hoạt động và tổng hợp ADN trên những đoạn có mồi gắn vào. 3. Ổn định ở nhiệt độ 720C trong vòng 10 phút. Các đoạn ADN ở các chu kì trước nếu chưa được tổng hợp xong sẽ được tổng hợp nốt.
4. Chấm dứt phản ứng và giữ ở nhiệt độ 40C để bảo quản.
b. Chu trình nhiệt phản ứng PCR khyếch đại gen cry4B :
1. Biến tính ban đầu ở nhiệt độ 950C trong 2 phút. ADN khuôn được biến tính. Mục đích là để phá vỡ các liên kết hyđro giữa hai mạch đơn và để hai mạch đơn tách nhau ra.
2. Phản ứng tiếp diễn theo chu kì, 30 chu kì, mỗi chu kì có các bước sau:
Gắn mồi ở nhiệt độ 500C, thời gian là 1 phút. Đoạn mồi gắn vào ADN khuôn sợi đơn theo nguyên tắc bổ sung giữa các bazơ nitơ.
Tổng hợp ADN ở nhiệt độ 720C trong thời gian 1 phút. Enzyme Taq ADN polymeraza hoạt động và tổng hợp ADN trên những đoạn có mồi gắn vào. 3. Ổn định ở nhiệt độ 720C trong vòng 5 phút. Các đoạn ADN ở các chu kì trước nếu chưa được tổng hợp xong sẽ được tổng hợp nốt.
4. Chấm dứt phản ứng và giữ ở nhiệt độ 40C để bảo quản.
2.2.6. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
Chủng vi khuẩn được nuôi qua đêm trên môi trường LB (hoặc MPB) khoảng 4ml trong điều kiện nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37 o
C
Lấy 1,5 ml dịch nuôi, ly tâm 6000 v/p (4 o
C, 10 phút).
Loại dịch nổi thu cặn, bổ sung 150 μl Sol I, vortex làm tan tủa. Bổ sung 150 μl Sol II, đảo nhẹ, thao tác nhanh.
Bổ sung 150 μl Sol III, đảo nhẹ, thao tác nhanh.
Ly tâm 10000 v/p (4 oC, 10 phút), thu dịch nổi
Bổ sung 1ml cồn tuyệt đối tủa ở -20 o
C trong 4 giờ
Ly tâm 10000 v/p (4 oC, 10 phút), thu tủa
Hòa tủa trong 45ml Rnase sau đó ủ 37 o
C trong 1 giờ
Đẩy nước D H2O lên tới 500 μl
Bổ sung 450 μl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) với tỉ lệ 1:1 sau đó ly tâm 12000 v/p (4 oC, 10 phút), thu dịch nổi.
Bổ sung NaOAC/KOAC (3 M, pH 5,2) với tỉ lệ 1NaOC/10 dịch nổi, đảo nhẹ. Bổ sung cồn tuyệt đối với tỉ lệ 2,5:1 (đạt khoảng 1500 μl)
Tủa DNA ở -20 oC, ít nhất 4 giờ.
Ly tâm 12000 v/p (4 oC, 10 phút), thu cặn, bổ sung 300 μl ethanol 70.
Ly tâm 12000 v/p (4 oC, 5 phút) , thu cặn. Làm khô bằng Speed Vac (5 phút, không đèn).
Bảo quản ở 4oC/-20oC.
Bổ sung 45 μl D H2O Bảo quản -20oC. Chạy PCR kiểm tra
2.2.7. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose
Nguyên tắc: Đây là phương pháp sử dụng để phân tích định tính cũng như định lượng của acid nucleic. Phương pháp điện di dựa vào cấu
trúc của acid nucleic. Acid nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, khi nó ở trong điện trường nó sẽ chịu tác động của lực hút điện trường và di chuyển về phía cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử này phụ thuộc vào hai chỉ tiêu là trọng lượng phân tử của acid và nồng độ các chất cấu thành gel.
Các bước tiến hành điện di:
Pha 0,8 % (1 %, 1,5 %) agarose, đun agarose tan hết, để nguội 50- 60oC, đổ gel, để đông lại
Nhấc lược ra, đặt bản gel vào bể điện di
Tra mẫu (có bổ sung đệm Loading Dye) vào các giếng
Đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di và tiến hành điện di ở 110V. Sau khi băng điện di chạy được 2/3 bản gel thì dừng lại, nhấc bản gel ra nhuộm bằng Ethydium bromide, 10 phút, rửa lại bằng nước
Soi gel trên máy để quan sát các băng DNA.
Quá trình điện di có thể kéo dài hoặc trong một thời gian ngắn, nó phụ thuộc vào điện thế của thiết bị. Nếu điện thế ổn định 100V thì thời gian điện di chỉ 25-30 phút, nhưng nếu điện thế thấp hơn 100V thì thời gian điện di kéo dài hơn.
Thuốc nhuộm Ethydium bromide có tác dụng phát huỳnh quang dưới ánh sáng tia tử ngoại giúp cho việc hiện hình các băng rõ ràng hơn. Dung dịch đệm (Loading Dye) lại có tác dụng làm tăng trọng lượng riêng của acid nucleic, vì vậy nó sẽ kéo phân tử acid lắng xuống đáy giếng.
2.2.8. Phƣơng pháp thôi gel
Sử dụng bộ kit thôi gel của hãng Invitrogen:
Bổ sung 700 μl GS1 vào 50 μl sản phẩm PCR.
Ủ ở 50o
C trong 10 phút
Chuyển hỗn hợp gel tan sang cột và đặt vào ống thu mẫu.
Loại dịch qua cột và đặt ống trở lại ống thu.
Bổ sung 0,5 ml GS1, ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, loại dịch qua cột.
Bổ sung 0,7 ml W9 có chứa methanol, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút.
Loại dịch qua cột, tiếp tục ly tâm 12000 v/p trong 1 phút.
Đặt cột vào ống effendof mới.
Bổ sung H2O để 10 phút.
Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, thu dịch qua cột.
Bảo quản ở -20o
C.
2.2.9. Phương pháp tách dòng gen cry4A, cry4B 2.2.9.1. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng 2.2.9.1. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng nhờ enzym nối T4 – DNA ligase. Thành phần phản ứng: Ligation Buffer 5µl Vectơ 1µl T4 – DNA ligase 1µl Sản phẩm PCR 4µl
Quá trình nối ghép được thực hiện trong điều kiện 4 – 6oC để tạo vectơ tái tổ hợp để qua đêm.
2.2.9.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α
Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong môi trường LB lỏng qua đêm. - Chuyển 0,5ml dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 50ml môi trường