Bộ huyết thanh miễn dịch chuẩn được thu nhận từ cấc chủng Bt chuẩn theo phương pháp của de Barjac và Bonnefoi, 1962.
Cấy các chủng Bacillus thuringiensis đã phân lập vào trong các ống nghiệm craige (một ống thủy tinh nhỏ cắm thẳng đứng vào môi trường MT1 chứa trong ống nghiệm to). Nuôi trong tủ ấm 280C sau 18 đến 24 giờ rồi chọn những ống craige chứa những tế bào vi khuẩn có khả năng chuyển động tốt đã chuyển động lên bề mặt phần môi trường MT1 ở giữa 2 ống. Cấy chuyển những tế bào này vào ống craige một lần nữa. Khi vi khuẩn phát triển trên ống Craige với thời gian chuyển động là 16-18 giờ thì cấy được vào ống nghiệm chứa 2- 3ml môi trường MPB rồi nuôi cấy lắc ở 70 vòng/phút từ 8-12 giờ.
Lấy 1l dịch nuôi nhỏ lên phiến kính lõm, quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trên kính hiển vi. Nếu vi khuẩn chuyển động tốt, nhỏ tiếp 1l huyết thanh chuẩn và quan sát sự ngưng kết của vi khuẩn. Thử lần lượt với các typ huyết thanh khác, ghi lại huyết thanh gây ra hiện tượng ngưng kết tức là khả năng làm cho vi khuẩn mất khả năng chuyển động hoàn toàn [3, 9,11].
2.2.5. Khuếch đại gen mã hóa độc tố bằng phản ứng PCR
Các chủng Bt phân lập sau khi định typ huyết thanh và có hiệu quả diệt muỗi cao được cấy được vào ống nghiệm có chứa 1,5 ml môi trường MPB, nuôi lắc ở 220 vòng/phút, trong 12 giờ ở nhiệt độ 280
C. Sau đó, đổ dịch nuôi cấy vào eppendorf ly tâm 6000 vòng trong 10 phút, thu cặn, rửa lại bằng nước cất khử ion đã khử trùng. Sau đó, hòa tan lại bằng 70l nước cất khử ion và xử lý mẫu ở 1000
C trong 10 phút. Li tâm nhanh, thu dịch nổi làm khuôn cho phản ứng PCR.
Thành phần phản ứng PCR cho một chủng và một cặp mồi: Thành phần của phản ứng PCR (30 μl):
dNTPs (100 mM) 2 μl MgCl2 4,8 μl Mồi xuôi (10 pM) 1 μl Mồi ngược (10 pM) 1 μl DNA khuôn 1 μl Taq polymeraza 5U 1 μl H2O khử ion vô trùng 17,2 μl
a. Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen cry4A:
1. Biến tính ban đầu ở nhiệt độ 940C trong 3 phút. ADN khuôn được biến tính. Mục đích là để phá vỡ các liên kết hydro giữa hai mạch đơn và để hai mạch đơn tách nhau ra.
2. Phản ứng tiếp diễn theo chu kì, 30 chu kì, mỗi chu kì có các bước sau:
Biến tính ở nhiệt độ 940C trong khoảng thời gian là 1 phút.
Gắn mồi ở nhiệt độ 560C, thời gian là 1 phút. Đoạn mồi gắn vào ADN khuôn sợi đơn theo nguyên tắc bổ sung giữa các bazơ nitơ.
Tổng hợp ADN ở nhiệt độ 720
trong thời gian 1 phút. Enzyme Taq ADN polymeraza hoạt động và tổng hợp ADN trên những đoạn có mồi gắn vào. 3. Ổn định ở nhiệt độ 720C trong vòng 10 phút. Các đoạn ADN ở các chu kì trước nếu chưa được tổng hợp xong sẽ được tổng hợp nốt.
4. Chấm dứt phản ứng và giữ ở nhiệt độ 40C để bảo quản.
b. Chu trình nhiệt phản ứng PCR khyếch đại gen cry4B :
1. Biến tính ban đầu ở nhiệt độ 950C trong 2 phút. ADN khuôn được biến tính. Mục đích là để phá vỡ các liên kết hyđro giữa hai mạch đơn và để hai mạch đơn tách nhau ra.
2. Phản ứng tiếp diễn theo chu kì, 30 chu kì, mỗi chu kì có các bước sau:
Gắn mồi ở nhiệt độ 500C, thời gian là 1 phút. Đoạn mồi gắn vào ADN khuôn sợi đơn theo nguyên tắc bổ sung giữa các bazơ nitơ.
Tổng hợp ADN ở nhiệt độ 720C trong thời gian 1 phút. Enzyme Taq ADN polymeraza hoạt động và tổng hợp ADN trên những đoạn có mồi gắn vào. 3. Ổn định ở nhiệt độ 720C trong vòng 5 phút. Các đoạn ADN ở các chu kì trước nếu chưa được tổng hợp xong sẽ được tổng hợp nốt.
4. Chấm dứt phản ứng và giữ ở nhiệt độ 40C để bảo quản.
2.2.6. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
Chủng vi khuẩn được nuôi qua đêm trên môi trường LB (hoặc MPB) khoảng 4ml trong điều kiện nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37 o
C
Lấy 1,5 ml dịch nuôi, ly tâm 6000 v/p (4 o
C, 10 phút).
Loại dịch nổi thu cặn, bổ sung 150 μl Sol I, vortex làm tan tủa. Bổ sung 150 μl Sol II, đảo nhẹ, thao tác nhanh.
Bổ sung 150 μl Sol III, đảo nhẹ, thao tác nhanh.
Ly tâm 10000 v/p (4 oC, 10 phút), thu dịch nổi
Bổ sung 1ml cồn tuyệt đối tủa ở -20 o
C trong 4 giờ
Ly tâm 10000 v/p (4 oC, 10 phút), thu tủa
Hòa tủa trong 45ml Rnase sau đó ủ 37 o
C trong 1 giờ
Đẩy nước D H2O lên tới 500 μl
Bổ sung 450 μl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) với tỉ lệ 1:1 sau đó ly tâm 12000 v/p (4 oC, 10 phút), thu dịch nổi.
Bổ sung NaOAC/KOAC (3 M, pH 5,2) với tỉ lệ 1NaOC/10 dịch nổi, đảo nhẹ. Bổ sung cồn tuyệt đối với tỉ lệ 2,5:1 (đạt khoảng 1500 μl)
Tủa DNA ở -20 oC, ít nhất 4 giờ.
Ly tâm 12000 v/p (4 oC, 10 phút), thu cặn, bổ sung 300 μl ethanol 70.
Ly tâm 12000 v/p (4 oC, 5 phút) , thu cặn. Làm khô bằng Speed Vac (5 phút, không đèn).
Bảo quản ở 4oC/-20oC.
Bổ sung 45 μl D H2O Bảo quản -20oC. Chạy PCR kiểm tra
2.2.7. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose
Nguyên tắc: Đây là phương pháp sử dụng để phân tích định tính cũng như định lượng của acid nucleic. Phương pháp điện di dựa vào cấu
trúc của acid nucleic. Acid nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, khi nó ở trong điện trường nó sẽ chịu tác động của lực hút điện trường và di chuyển về phía cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử này phụ thuộc vào hai chỉ tiêu là trọng lượng phân tử của acid và nồng độ các chất cấu thành gel.
Các bước tiến hành điện di:
Pha 0,8 % (1 %, 1,5 %) agarose, đun agarose tan hết, để nguội 50- 60oC, đổ gel, để đông lại
Nhấc lược ra, đặt bản gel vào bể điện di
Tra mẫu (có bổ sung đệm Loading Dye) vào các giếng
Đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di và tiến hành điện di ở 110V. Sau khi băng điện di chạy được 2/3 bản gel thì dừng lại, nhấc bản gel ra nhuộm bằng Ethydium bromide, 10 phút, rửa lại bằng nước
Soi gel trên máy để quan sát các băng DNA.
Quá trình điện di có thể kéo dài hoặc trong một thời gian ngắn, nó phụ thuộc vào điện thế của thiết bị. Nếu điện thế ổn định 100V thì thời gian điện di chỉ 25-30 phút, nhưng nếu điện thế thấp hơn 100V thì thời gian điện di kéo dài hơn.
Thuốc nhuộm Ethydium bromide có tác dụng phát huỳnh quang dưới ánh sáng tia tử ngoại giúp cho việc hiện hình các băng rõ ràng hơn. Dung dịch đệm (Loading Dye) lại có tác dụng làm tăng trọng lượng riêng của acid nucleic, vì vậy nó sẽ kéo phân tử acid lắng xuống đáy giếng.
2.2.8. Phƣơng pháp thôi gel
Sử dụng bộ kit thôi gel của hãng Invitrogen:
Bổ sung 700 μl GS1 vào 50 μl sản phẩm PCR.
Ủ ở 50o
C trong 10 phút
Chuyển hỗn hợp gel tan sang cột và đặt vào ống thu mẫu.
Loại dịch qua cột và đặt ống trở lại ống thu.
Bổ sung 0,5 ml GS1, ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, loại dịch qua cột.
Bổ sung 0,7 ml W9 có chứa methanol, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút.
Loại dịch qua cột, tiếp tục ly tâm 12000 v/p trong 1 phút.
Đặt cột vào ống effendof mới.
Bổ sung H2O để 10 phút.
Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, thu dịch qua cột.
Bảo quản ở -20o
C.
2.2.9. Phương pháp tách dòng gen cry4A, cry4B 2.2.9.1. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng 2.2.9.1. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng nhờ enzym nối T4 – DNA ligase. Thành phần phản ứng: Ligation Buffer 5µl Vectơ 1µl T4 – DNA ligase 1µl Sản phẩm PCR 4µl
Quá trình nối ghép được thực hiện trong điều kiện 4 – 6oC để tạo vectơ tái tổ hợp để qua đêm.
2.2.9.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α
Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong môi trường LB lỏng qua đêm. - Chuyển 0,5ml dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 50ml môi trường LB, lắc 200 vòng/phút trong 2h ở 370C. Đo OD600 đạt 0,5 – 0,6 thì lấy mẫu đặt trên đá 1h. Sau từ bước này thao tác luôn phải được thực hiện ở 40
C.
- Mẫu sau đặt đá 1h đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch nổi. Hòa tế bào thu được trong 50ml CaCl2 100mM vô trùng, ủ trong 15 phút và ly tâm thu tủa ở 6000 vòng/ phút.
- Hòa lại tủa trong 25 ml CaCl2 100mM, ủ mẫu trên đá trong 60 phút. - Ủ xong ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hòa tế bào trong 0,5 ml CaCl2 100mM, bổ xung 15% glycerol. Hút 10 μl dịch tế bào vào mỗi ống eppendorf và bảo quản -800
C.
Biến nạp:
- Hút 5 μl sản phẩm của phản ứng nối ghép gen vào ống eppendorf đựng dung dịch tế bào khả biến và trộn đều, để đá 30 phút (nhằm tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều), sốc nhiệt 420
C trong 60 giây đến 90 giây sau đó giữ hỗn hợp này trong đá 2 phút. Bổ sung thêm 300 μl môi trường LB và lắc ở 370C 200 vòng/phút trong 1 đến 1,5 giờ. Trải 50 μl sản phẩm trên đĩa petri chứa môi trường MPA có bổ xung Ampicillin + X-gal, nuôi ở 370C từ 14h – 16h.
2.2.9.3. Phương pháp tách DNA plasmid của vi khuẩn E.coli DH5α
Lấy khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc màu trắng), và khuẩn lạc vi khuẩn không chứa plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc màu xanh) làm đối chứng cấy vào 2ml môi trường LB có chứa chất kháng sinh Ampicillin nồng độ 100mg/ml, lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37oC.
Quá trình tách plasmid được tiến hành như với tách DNA plasmid vi khuẩn Bt.
- Để xác định chính xác vectơ tái tổ hợp có mang đoạn gen mong muốn hay không, chúng tôi tiến hành cắt đoạn DNA đã ghép nối vào plasmid bằng enzym EcoRI.
- Trình tự enzym EcoRI
5’……GAATTC……3’ 3’……CTTAAG……5’
- Thành phần phản ứng:
EcoRI 0,3µl Buffer 1µl DNA 3µl Nước khử ion 5,7µl
- Quá trình cắt được thực hiện ở 37oC qua đêm.
2.2.10. Xác định trình tự nucleotid của đoạn gen đã tách dòng
Tiến hành theo phương pháp tổng hợp của Sanger và cộng sự.
Thực hiện phản ứng PCR ngoài các thành phần thông thường còn bổ sung thêm loại dideoxynuceotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) đã được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang.
Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid có bổ sung ure làm tăng khả năng phân giải của gen. Dùng tia laze quét để phát hiện dideoxynucleotid đánh dấu.
Xử lý kết quả bằng phần mềm Bioedit, Blast, sau đó tiến hành so sánh trình tự gen đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen quốc tế.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu lá
Từ 31 mẫu đất thu thập từ các vùng khác nhau ở Nha Trang được tiến hành phân lập theo phương pháp đã nêu ở phần vật liệu, phương pháp nghiên cứu. Sau 3 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp, trên đĩa thạch chứa môi trường MPA mọc lên nhiều loại khuẩn lạc khác nhau trong đó chủ yếu là khuẩn lạc của các loài sinh bào tử thuộc chi Bacillus, khuẩn lạc giống Bt là những khuẩn lạc: Tròn, có màu trắng sữa, có thể có mép nhăn hoặc không (hình 3.1).
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của chủng Bacillus thuringiensis phát triển trên môi trƣờng MPA sau 72 giờ nuôi cấy.
Từ mỗi mẫu tách ra từ 10 – 12 khuẩn lạc riêng rẽ, đặc trưng cho nhóm Bc – Bt để làm tiêu bản, nhuộm bằng thuốc nhuộm fucshin và soi trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu, qua đó lựa chọn các chủng Bt có khả năng hình thành tinh thể và bào tử.
Kết quả từ 31 mẫu đất thu thập từ các vùng khác nhau của Nha Trang đã phân lập được 383 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Trong đó, đã xác định được 185 chủng Bacillus thuringiensis hình thành tinh thể cùng với bào tử. Chỉ số Bt =
383 185
= 0,483. Trong 31 mẫu đất có 4 mẫu đất không phân lập
được Bt và có 27 mẫu phân lập được Bt, tần suất xuất hiện Bt là = 31 27 = 0,871. Lựa chọn những khuẩn lạc thuộc chi Bacillus Không cựa chọn khuẩn lạc thuộc các chi khác
3.2. Sự đa dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis phân lập
Bacillus thuringiensis có 4 dạng tinh thể: Hình cầu, hình tháp, hình lập phương và hình không xác định. Các chủng khác nhau chứa các tinh thể có hình dạng khác nhau. Trên Hình 3.2 các tế bào có hình que, các bào tử các hình bầu dục và tinh thể có hình tròn, chúng bắt mầu đậm nhạt khác nhau khi nhuộm.
Hình 3.2. Hình thái bào tử và tinh thể của chủng ĐNT8.1 chụp dƣới kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 5000 lần.
1: tinh thể 2: tế bào 3: bào tử
Bằng phương pháp quan sát trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với tiêu bản nhuộm đơn bằng fushin. Chúng tôi tiến hành phân loại hình dạng tinh thể cho các chủng Bt đã phân lập, kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thống kê số lƣợng chủng Bt phân lập đƣợc và hình dạng tinh thể của chủng phân lập. STT Hình dạng Số lượng chủng Chiếm tỷ lệ (%) 1 Cầu 120 64,56 2 Tháp 40 21,62 3 Lập phương 4 2,16 4 Không xác định 16 8,65 5 Tháp-cầu 5 2,7 Tổng số 185 100 1 2 3
Từ 185 chủng phân lập được, tiến hành soi tiêu bản đó qua nhuộm bằng thuốc nhuộm fushin đó thu được kết quả có 120 chủng sinh tinh thể hình cầu chiếm 64,56%, 40 chủng sinh tinh thể hình tháp chiếm 21,62%, 4 chủng sinh tinh thể hình lập phương chiếm 2,16%, 5 chủng sinh cả hai loại tinh thể hình tháp và hình cầu chiếm 2,7% và 16 chủng sinh tinh thể hình không xác định chiếm 8,65%.
Số liệu thống kê trên cho thấy các chủng Bt có khả năng sinh ra một loại tinh thể là chiếm ưu thế (97,3%) so với các chủng Bt sinh hai loại tinh thể có hình dạng khác nhau (2,7%). Các chủng sinh tinh thể hình tròn chiếm đa số (64,56%). Như vậy, các mẫu đất ở Nha Trang chủ yếu chứa Bt sinh tinh thể hình cầu.
3.3. Phân loại dƣới loài của các chủng Bacillus thuringiensis
Hình 3.3. Phản ứng ngƣng kết của Bacillus thuringiensis var. israelensis với kháng huyết thanh.
A. Tế bào chuyển động
B. Phản ứng ngƣng kết tạo đám với kháng huyết thanh
Với 185 chủng vi khuẩn phân lập được chúng tôi tiến hành sàng lọc để chọn dưới loài Bacillus thuringiensis var. israelensis bằng cách dùng typ huyết thanh chuẩn phân loại Bti là huyết thanh số 14. Kết quả là đã có 43 chủng ngưng kết với typ huyết thanh này đạt tỷ lệ 23,2% (Hình 3.3).
3.4. Thử nghiệm hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus của các chủng Bacillus thuringiensis các chủng Bacillus thuringiensis
3.4.1. Xác định nồng độ bào tử
Nồng độ bào tử đã được xác định theo phương pháp miêu tả ở mục 2.2.2.
Nồng độ bào tử của các chủng thử hoạt tính đều dao động trong khoảng 108 và 109 bào tử/ml.
3.4.2. Thử nghiệm hoạt tính
Các chủng Bt được pha loãng tới nồng độ 1x104 và 1x106 bào tử/ml bằng nước cất vô trùng. Tiến hành thử nghiệm hoạt tính diệt ấu trùng muỗi theo phương pháp đã trình bày ở phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu.