2.2.9.1. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng nhờ enzym nối T4 – DNA ligase. Thành phần phản ứng: Ligation Buffer 5µl Vectơ 1µl T4 – DNA ligase 1µl Sản phẩm PCR 4µl
Quá trình nối ghép được thực hiện trong điều kiện 4 – 6oC để tạo vectơ tái tổ hợp để qua đêm.
2.2.9.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α
Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong môi trường LB lỏng qua đêm. - Chuyển 0,5ml dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 50ml môi trường LB, lắc 200 vòng/phút trong 2h ở 370C. Đo OD600 đạt 0,5 – 0,6 thì lấy mẫu đặt trên đá 1h. Sau từ bước này thao tác luôn phải được thực hiện ở 40
C.
- Mẫu sau đặt đá 1h đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch nổi. Hòa tế bào thu được trong 50ml CaCl2 100mM vô trùng, ủ trong 15 phút và ly tâm thu tủa ở 6000 vòng/ phút.
- Hòa lại tủa trong 25 ml CaCl2 100mM, ủ mẫu trên đá trong 60 phút. - Ủ xong ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hòa tế bào trong 0,5 ml CaCl2 100mM, bổ xung 15% glycerol. Hút 10 μl dịch tế bào vào mỗi ống eppendorf và bảo quản -800
C.
Biến nạp:
- Hút 5 μl sản phẩm của phản ứng nối ghép gen vào ống eppendorf đựng dung dịch tế bào khả biến và trộn đều, để đá 30 phút (nhằm tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều), sốc nhiệt 420
C trong 60 giây đến 90 giây sau đó giữ hỗn hợp này trong đá 2 phút. Bổ sung thêm 300 μl môi trường LB và lắc ở 370C 200 vòng/phút trong 1 đến 1,5 giờ. Trải 50 μl sản phẩm trên đĩa petri chứa môi trường MPA có bổ xung Ampicillin + X-gal, nuôi ở 370C từ 14h – 16h.
2.2.9.3. Phương pháp tách DNA plasmid của vi khuẩn E.coli DH5α
Lấy khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc màu trắng), và khuẩn lạc vi khuẩn không chứa plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc màu xanh) làm đối chứng cấy vào 2ml môi trường LB có chứa chất kháng sinh Ampicillin nồng độ 100mg/ml, lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37oC.
Quá trình tách plasmid được tiến hành như với tách DNA plasmid vi khuẩn Bt.
- Để xác định chính xác vectơ tái tổ hợp có mang đoạn gen mong muốn hay không, chúng tôi tiến hành cắt đoạn DNA đã ghép nối vào plasmid bằng enzym EcoRI.
- Trình tự enzym EcoRI
5’……GAATTC……3’ 3’……CTTAAG……5’
- Thành phần phản ứng:
EcoRI 0,3µl Buffer 1µl DNA 3µl Nước khử ion 5,7µl
- Quá trình cắt được thực hiện ở 37oC qua đêm.
2.2.10. Xác định trình tự nucleotid của đoạn gen đã tách dòng
Tiến hành theo phương pháp tổng hợp của Sanger và cộng sự.
Thực hiện phản ứng PCR ngoài các thành phần thông thường còn bổ sung thêm loại dideoxynuceotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) đã được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang.
Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid có bổ sung ure làm tăng khả năng phân giải của gen. Dùng tia laze quét để phát hiện dideoxynucleotid đánh dấu.
Xử lý kết quả bằng phần mềm Bioedit, Blast, sau đó tiến hành so sánh trình tự gen đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen quốc tế.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu lá
Từ 31 mẫu đất thu thập từ các vùng khác nhau ở Nha Trang được tiến hành phân lập theo phương pháp đã nêu ở phần vật liệu, phương pháp nghiên cứu. Sau 3 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp, trên đĩa thạch chứa môi trường MPA mọc lên nhiều loại khuẩn lạc khác nhau trong đó chủ yếu là khuẩn lạc của các loài sinh bào tử thuộc chi Bacillus, khuẩn lạc giống Bt là những khuẩn lạc: Tròn, có màu trắng sữa, có thể có mép nhăn hoặc không (hình 3.1).
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của chủng Bacillus thuringiensis phát triển trên môi trƣờng MPA sau 72 giờ nuôi cấy.
Từ mỗi mẫu tách ra từ 10 – 12 khuẩn lạc riêng rẽ, đặc trưng cho nhóm Bc – Bt để làm tiêu bản, nhuộm bằng thuốc nhuộm fucshin và soi trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu, qua đó lựa chọn các chủng Bt có khả năng hình thành tinh thể và bào tử.
Kết quả từ 31 mẫu đất thu thập từ các vùng khác nhau của Nha Trang đã phân lập được 383 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Trong đó, đã xác định được 185 chủng Bacillus thuringiensis hình thành tinh thể cùng với bào tử. Chỉ số Bt =
383 185
= 0,483. Trong 31 mẫu đất có 4 mẫu đất không phân lập
được Bt và có 27 mẫu phân lập được Bt, tần suất xuất hiện Bt là = 31 27 = 0,871. Lựa chọn những khuẩn lạc thuộc chi Bacillus Không cựa chọn khuẩn lạc thuộc các chi khác
3.2. Sự đa dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis phân lập
Bacillus thuringiensis có 4 dạng tinh thể: Hình cầu, hình tháp, hình lập phương và hình không xác định. Các chủng khác nhau chứa các tinh thể có hình dạng khác nhau. Trên Hình 3.2 các tế bào có hình que, các bào tử các hình bầu dục và tinh thể có hình tròn, chúng bắt mầu đậm nhạt khác nhau khi nhuộm.
Hình 3.2. Hình thái bào tử và tinh thể của chủng ĐNT8.1 chụp dƣới kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 5000 lần.
1: tinh thể 2: tế bào 3: bào tử
Bằng phương pháp quan sát trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với tiêu bản nhuộm đơn bằng fushin. Chúng tôi tiến hành phân loại hình dạng tinh thể cho các chủng Bt đã phân lập, kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thống kê số lƣợng chủng Bt phân lập đƣợc và hình dạng tinh thể của chủng phân lập. STT Hình dạng Số lượng chủng Chiếm tỷ lệ (%) 1 Cầu 120 64,56 2 Tháp 40 21,62 3 Lập phương 4 2,16 4 Không xác định 16 8,65 5 Tháp-cầu 5 2,7 Tổng số 185 100 1 2 3
Từ 185 chủng phân lập được, tiến hành soi tiêu bản đó qua nhuộm bằng thuốc nhuộm fushin đó thu được kết quả có 120 chủng sinh tinh thể hình cầu chiếm 64,56%, 40 chủng sinh tinh thể hình tháp chiếm 21,62%, 4 chủng sinh tinh thể hình lập phương chiếm 2,16%, 5 chủng sinh cả hai loại tinh thể hình tháp và hình cầu chiếm 2,7% và 16 chủng sinh tinh thể hình không xác định chiếm 8,65%.
Số liệu thống kê trên cho thấy các chủng Bt có khả năng sinh ra một loại tinh thể là chiếm ưu thế (97,3%) so với các chủng Bt sinh hai loại tinh thể có hình dạng khác nhau (2,7%). Các chủng sinh tinh thể hình tròn chiếm đa số (64,56%). Như vậy, các mẫu đất ở Nha Trang chủ yếu chứa Bt sinh tinh thể hình cầu.
3.3. Phân loại dƣới loài của các chủng Bacillus thuringiensis
Hình 3.3. Phản ứng ngƣng kết của Bacillus thuringiensis var. israelensis với kháng huyết thanh.
A. Tế bào chuyển động
B. Phản ứng ngƣng kết tạo đám với kháng huyết thanh
Với 185 chủng vi khuẩn phân lập được chúng tôi tiến hành sàng lọc để chọn dưới loài Bacillus thuringiensis var. israelensis bằng cách dùng typ huyết thanh chuẩn phân loại Bti là huyết thanh số 14. Kết quả là đã có 43 chủng ngưng kết với typ huyết thanh này đạt tỷ lệ 23,2% (Hình 3.3).
3.4. Thử nghiệm hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus của các chủng Bacillus thuringiensis các chủng Bacillus thuringiensis
3.4.1. Xác định nồng độ bào tử
Nồng độ bào tử đã được xác định theo phương pháp miêu tả ở mục 2.2.2.
Nồng độ bào tử của các chủng thử hoạt tính đều dao động trong khoảng 108 và 109 bào tử/ml.
3.4.2. Thử nghiệm hoạt tính
Các chủng Bt được pha loãng tới nồng độ 1x104 và 1x106 bào tử/ml bằng nước cất vô trùng. Tiến hành thử nghiệm hoạt tính diệt ấu trùng muỗi theo phương pháp đã trình bày ở phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu.
Tiến hành thử hoạt tính cho 43 chủng Bt phân lập. Tỉ lệ ấu trùng muỗi chết được xác định sau 6, 12, 24 giờ. Kết quả thử nghiệm được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.4.
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus của các chủng phân lập sau các khoảng thời gian khác nhau, ở các
nồng độ khác nhau.
STT Chñng
TØ lÖ chÕt (%)
6 giê 12 giê 24 giê
106 BT/ml 104 BT/ml 106 BT/ml 104 BT/ml 106 BT/ml 104 BT/ml 1 ĐNT 8.3 83,33 70 93,33 86,67 100 100 2 ĐNT 8.1 90 83,33 100 96,67 - 100 3 ĐNT 7.6 70 65 83,33 70 93,33 86,67 4 ĐNT 22.6 70 50 83,33 70 83,33 70 5 ĐNT 22.8 93,33 86,67 100 96,67 - 100
6 ĐNT 8.6 86,67 73,33 100 93,33 - 100 7 ĐNT 20.5 93,33 80 100 90 - 100 8 ĐNT 4.5 93,33 83,33 100 93,33 - 100 9 ĐNT 8.7 76,67 66,67 93,33 80 100 100 10 ĐNT 6.10 70 65 83,33 70 93,33 86,67 11 ĐNT 19.9 83,33 70 96,67 83,33 100 93,33 12 ĐNT 17.6 70 65 83,33 70 93,33 86,67 13 ĐNT 6.1 66,67 50 83,33 76,67 90 83,33 14 ĐNT 5.3 70 65 83,33 70 93,33 86,67 15 ĐNT 19.8 83,33 76,67 96,67 86,67 100 100 16 ĐNT 20.1 83,33 76,67 96,67 86,67 100 100 17 ĐNT 20.2 96,67 90 100 100 - - 18 ĐNT 7.4 70 65 83,33 70 93,33 86,67 19 ĐNT 7.1 83,33 76,67 100 86,67 - 100 20 ĐNT 6.16 66,67 50 83,33 76,67 90 83,33 21 ĐNT 6.18 70 50 83,33 70 93,33 86,67 22 ĐNT 6.13 76,67 65 86,67 70 93,33 86,67 23 ĐNT 19.6 70 65 100 70 - 83,33 24 ĐNT 6.15 76,67 66,67 90 83,33 100 96,67 25 ĐNT 16.7 70 65 83,33 70 93,33 86,67 26 ĐNT 8.5 65 50 83,33 70 86,67 83,33 27 ĐNT 12.3 65 50 83,33 70 86,67 83,33 28 ĐNT 17.1 50 40 70 66,67 83,33 70 29 ĐNT 5.4 87,67 80 96,67 93,33 100 100 30 ĐNT 6.9 65 50 83,33 70 86,67 83,33
31 ĐNT 4.7 70 65 83,33 70 93,33 86,67 32 ĐNT 6.17 50 40 70 66,67 83,33 70 33 ĐNT 6.14 65 40 66,67 50 76,67 65 34 ĐNT 16.6 65 50 83,33 70 86,67 83,33 35 ĐNT 5.6 70 65 83,33 70 93,33 86,67 36 ĐNT 2.8 83,33 76,67 96,67 87,67 100 100 37 ĐNT 6.5 65 40 66,67 50 76,67 65 38 ĐNT 6.6 50 40 66,67 65 83,33 70 39 ĐNT 8.10 93,33 86,67 100 93,33 - 100 40 ĐNT 7.3 50 40 66,67 65 83,33 70 41 ĐNT 6.11 65 40 66,67 50 76,67 65 42 ĐNT 6.8 65 50 83,33 70 86,67 83,33 43 ĐNT 8.9 70 65 83,33 70 93,33 86,67 44 4Q1 86,67 76,67 100 93,33 - 100
Từ kết quả trên cho thấy, các chủng Bacillus thuringiensis phân lập đều có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus cao. Sau 24 giờ thử hoạt tính ở nồng độ 106
bào tử/ml, tất cả các chủng thử nghiệm đều có hoạt lực diệt ấu trùng muỗi với tỷ lệ là > 75 %. Trong đó, có hơn 50% những chủng có tỉ lệ diệt 100%. Ở nồng độ 104
bào tử/ml kết quả cũng tương tự, hơn 65 % ấu trùng muỗi ở tất các các mẫu thử nghiệm đều bị tiêu diệt trong đó các chủng chết 100% chiếm hơn 50%. Ấu trùng muỗi Culex thích sống ở các vùng nước tù ô nhiễm như: ao, mương, cống rãnh và Culex là loại muỗi chính lây truyền bệnh viêm não Nhật Bản, mà đối tượng chủ yếu lây bệnh chủ yếu lại là trẻ em dưới 15 tuổi với tỷ lệ gây tử vong cao nên cần phải nghiên cứu các chủng phân lập kỹ hơn để có thể áp dụng vào sản xuất chế phẩm sinh học diệt muỗi.
Hình 3.4. Hình ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex
quinquefasciatus của các chủng phân lập
3.5. Phát hiện gen mã hóa protein diệt ấu trùng muỗi của chủng Bacillus
thuringiensis phân lập
Họ gen cry4 trong đó có gen cry4A và cry4B mã hóa protein diệt côn trùng bộ 2 cánh là họ gen được nhiều nhà khoa học quan tâm. Để phát hiện gen độc tố này chúng tôi sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại gen cry4A và cry4B với cặp mồi đặc hiệu. Theo tính toán lý thuyết, đoạn gen cry4A sau khi tổng hợp với cặp mồi đặc hiệu 4A3 và 4A5 có kích thước khoảng 1035 bp
và cry4B sau khi tổng hợp với cặp mồi đặc hiệu 4BF và 4BR sẽ thu được sản phẩm có kích thước 321 bp. Từ những kết quả thử nghiệm hoạt tính của các chủng phân lập thu nhận được, chúng tôi tiến hành khuyếch đại gen độc tố
cry4A và cry4B của các chủng phân lập. Kết quả khuếch đại gen độc tố được thể hiện ở bảng 3.3, hình 3.5 và hình 3.6.
Bảng 3.3. Kết quả khuếch đại gen độc tố thuộc nhóm cry4 của các chủng phân lập
STT Ký hiệu chủng Gen Cry 4A Gen Cry 4B
1. ĐNT 20.2 + + 2. ĐNT 8.10 + + 3. ĐNT 2.8 + + 4. ĐNT 8.1 + + 5. ĐNT 19.9 + + 6. ĐNT 8.7 + + 7. ĐNT 7.1 + + 8. ĐNT 6.15 + + 9. ĐNT 22.8 + - 10. ĐNT 4.5 + + 11. ĐNT 8.3 + + 12. ĐNT 8.6 + + 13. ĐNT 20.1 + + 14. ĐNT 19.8 + + 15. ĐNT 20.5 + + 16. ĐNT 4Q1 + + 17. ĐNT 5.4 - + Chú thích:
-: Không xuất hiện gen độc tố +: Có xuất hiện gen độc tố
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho gen Cry4A trên gel agarose1%.
Giếng 1 3: ĐNT 20.2, ĐNT 8.6, ĐNT 2.8. Giếng 4: Thang DNA chuẩn (Fermentas). Giếng 5 8: ĐNT 22.8, ĐNT 4.5, ĐNT 8.3
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho gen cry4B trên gel agarose1%.
Giếng 1: Thang DNA chuẩn (Fermentas).
Giếng 2 - 8: ĐNT 20.2, ĐNT 8.6, ĐNT 2.8, ĐNT 22.8, ĐNT 4.5, ĐNT 8.3
Từ 30 chủng phân lập có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi cao, khi tiến hành khuyếch đại gen cry4A và cry4B chúng tôi đã thu được 16 chủng có xuất hiện các băng có kích thước tương đương với kích thước lý thuyết. Như vậy, có thể kết luận sơ bộ các chủng này có mang gen cry4A và cry4B trong đó có:
o 14 chủng chứa cả gen cry4A và cry4B, chiếm 46,6 %,
o 1 chủng chỉ chứa gen cry4B, không chứa gen cry4A, chiếm 3,4 %
o 14 chủng không mang cả hai gen cry4A và cry4B, chiếm 46,6 %. Để khẳng định chắc chắn các chủng này mang các gen độc tố diệt muỗi
cry4A và cry4B chúng tôi tiến hành chọn chủng ĐNT20.2 có hoạt tính diệt ấu trung muỗi cao nhất có khả năng mang 2 gen cry4A, cry4B và 2 chủng ĐNT22.8 và ĐNT5.4 có khả năng mang 1 trong 2 gen cry4A và cry4B để tách dòng và đọc trình tự.
3.6. Tách dòng, đọc trình tự gen cry4A và cry4B 3.6.1. Tách dòng gen cry4A và gen cry4B 3.6.1. Tách dòng gen cry4A và gen cry4B
3.6.1.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng
Vector pGEM-T Easy tồn tại ở dạng mạch thẳng với hai đầu tự do mỗi đầu thừa ra một nucleotide T nên dễ dàng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu so le A của sản phẩm PCR sử dụng Taq polymerase. Vì thế, chúng tôi lựa chọn vector pGEM-T Easy làm vector tách dòng. Các đoạn gen cry4A tính toán theo lý thuyết là 1035 bp và đoạn gen cry4B là 321 bp thu được từ phản ứng PCR của 3 chủng được gắn trực tiếp vào vector pGEM-T Easy bằng enzym T4 – ligase ở 40C. Sản phẩm là vector tái tổ hợp pGEM-T Easy –
cry4A – ĐNT 20.2, pGEM-T Easy – cry4A – 22.8, pGEM -T Easy – cry4B – ĐNT 5.4, pGEM-T Easy – cry4B – ĐNT 20.2.
3.6.1.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5α
Vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt, sau đó cấy trải trên môi trường LBA có bổ sung Ampicillin và Xgal nuôi ở 370
C. Sau 14 – 16 h thấy xuất hiện các khuẩn lạc xanh trắng trên đĩa petri (hình 3.7).
Các dòng vi khuẩn sinh trưởng được trên môi trường chứa kháng sinh