thuringiensis phân lập
Họ gen cry4 trong đó có gen cry4A và cry4B mã hóa protein diệt côn trùng bộ 2 cánh là họ gen được nhiều nhà khoa học quan tâm. Để phát hiện gen độc tố này chúng tôi sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại gen cry4A và cry4B với cặp mồi đặc hiệu. Theo tính toán lý thuyết, đoạn gen cry4A sau khi tổng hợp với cặp mồi đặc hiệu 4A3 và 4A5 có kích thước khoảng 1035 bp
và cry4B sau khi tổng hợp với cặp mồi đặc hiệu 4BF và 4BR sẽ thu được sản phẩm có kích thước 321 bp. Từ những kết quả thử nghiệm hoạt tính của các chủng phân lập thu nhận được, chúng tôi tiến hành khuyếch đại gen độc tố
cry4A và cry4B của các chủng phân lập. Kết quả khuếch đại gen độc tố được thể hiện ở bảng 3.3, hình 3.5 và hình 3.6.
Bảng 3.3. Kết quả khuếch đại gen độc tố thuộc nhóm cry4 của các chủng phân lập
STT Ký hiệu chủng Gen Cry 4A Gen Cry 4B
1. ĐNT 20.2 + + 2. ĐNT 8.10 + + 3. ĐNT 2.8 + + 4. ĐNT 8.1 + + 5. ĐNT 19.9 + + 6. ĐNT 8.7 + + 7. ĐNT 7.1 + + 8. ĐNT 6.15 + + 9. ĐNT 22.8 + - 10. ĐNT 4.5 + + 11. ĐNT 8.3 + + 12. ĐNT 8.6 + + 13. ĐNT 20.1 + + 14. ĐNT 19.8 + + 15. ĐNT 20.5 + + 16. ĐNT 4Q1 + + 17. ĐNT 5.4 - + Chú thích:
-: Không xuất hiện gen độc tố +: Có xuất hiện gen độc tố
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho gen Cry4A trên gel agarose1%.
Giếng 1 3: ĐNT 20.2, ĐNT 8.6, ĐNT 2.8. Giếng 4: Thang DNA chuẩn (Fermentas). Giếng 5 8: ĐNT 22.8, ĐNT 4.5, ĐNT 8.3
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho gen cry4B trên gel agarose1%.
Giếng 1: Thang DNA chuẩn (Fermentas).
Giếng 2 - 8: ĐNT 20.2, ĐNT 8.6, ĐNT 2.8, ĐNT 22.8, ĐNT 4.5, ĐNT 8.3
Từ 30 chủng phân lập có hoạt tính diệt ấu trùng muỗi cao, khi tiến hành khuyếch đại gen cry4A và cry4B chúng tôi đã thu được 16 chủng có xuất hiện các băng có kích thước tương đương với kích thước lý thuyết. Như vậy, có thể kết luận sơ bộ các chủng này có mang gen cry4A và cry4B trong đó có:
o 14 chủng chứa cả gen cry4A và cry4B, chiếm 46,6 %,
o 1 chủng chỉ chứa gen cry4B, không chứa gen cry4A, chiếm 3,4 %
o 14 chủng không mang cả hai gen cry4A và cry4B, chiếm 46,6 %. Để khẳng định chắc chắn các chủng này mang các gen độc tố diệt muỗi
cry4A và cry4B chúng tôi tiến hành chọn chủng ĐNT20.2 có hoạt tính diệt ấu trung muỗi cao nhất có khả năng mang 2 gen cry4A, cry4B và 2 chủng ĐNT22.8 và ĐNT5.4 có khả năng mang 1 trong 2 gen cry4A và cry4B để tách dòng và đọc trình tự.