Nguyên tắc
Sử dụng các phương pháp cơ học và hóa học để loại bỏ màng, tế bào chất, protein, RNA chỉ thu nhận DNA.
Mục tiêu
Tách chiết DNA tổng số để phân lập các gen cần thiết. Tiến hành
Chuẩn bị các hóa chất (có sẵn trong bộ kit tách chiết DNA): dung dịch tách chiết, dung dịch SDS 20%, hỗn hợp phenol-chloroform, iso-propanol, TE, enzyme RNAse (2 mg/ml), cồn 90.
Thực hiện Tách chiết DNA thực vật
Cắt một mảnh mô nhỏ và nghiền trong eppendorf 1.5 ml bằng dụng cụ nghiền.
Thêm 400 µl dung dịch tách chiết và nghiền thêm vài phút cho mẫu bị nghiền nát.
Thêm 30 µl của dung dịch SDS 20%, vortex và ủ ở 65oC trong 10 phút.
Cho thêm 400 µl hỗn hợp phenol-chloroform, vortex và ly tâm trong 5 phút.
Thu nhận phần dịch trên vào eppendorf mới.
Có thể lặp lại bước 4 và 5.
Cho 300 µl iso-propanol và giữ trong đá khoảng 10 phút.
Ly tâm ở 3000 vòng trong 5 phút và cẩn thận loại bỏ dịch phía trên.
Thêm 100 µl cồn 70%, ly tâm trong 5 phút và cẩn thận loại bỏ cồn.
Để khô mẫu khoảng 20-30 phút và hoà tan kết tủa trong 40 µl TE.
Thêm 2 µl enzyme RNAse (2 mg/ml) và ủ ở 37oC trong 30 phút. DNA có thể sử dụng ngay hoặc bảo quản trong -20oC.
2.3.7. Phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen mong muốn trong tế bào thực vật.
Nguyên tắc
Kỹ thuật PCR được thực hiện khi biết rõ các trình tự đặc hiệu ở hai đầu đoạn DNA cần khuếch đại để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu. Trường hợp chỉ biết có một trình tự đặc hiệu ở một đầu đoạn khuôn thì chỉ thiết kế được một loại mồi, phải sử dụng các kỹ thuật PCR đặc hiệu mới đảm bảo nhân gen có hiệu quả.
Mục tiêu
Khuếch đại đoạn gen ipt lên nhiều lần.
Tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị hoá chất
Để rã đông DNA, buffer 10X, dNTP, primer trong bình đá vụn (luôn luôn giữ các chất trên trong đá, sau khi dùng xong chuyển ngay vào -20oC). Riêng Tag polimerase vẫn giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng, sau khi lấy xong phải cất ngay vào -20oC. Nếu không, các chất này sẽ bị giảm tác dụng khi để ở nhiệt độ phòng.
Mồi được cung cấp bởi phòng Công nghệ gen. Trình tự mồi khuếch đại đoạn
gen hpt như sau:
Mồi hpt xuôi: 5’ - CGTCGTTCGAGAAGTTTC - 3’
Mồi hpt ngược: 5’ - TACTTCTACACAGCCATC - 3’
Bước 2: Đánh số lên ống eppendorf. Cho vào ống theo thứ tự:
dNTP: 5 μl (nồng độ đạt 2mM cho mỗi loại dNTP).
10X buffer PCR: 5 μl (có sẵn khi mua Tag Polymerase).
Primer : 2 μl (nồng độ từ 50-100 ng).
Mẫu DNA: 5 μl (thay đổi tuỳ nồng độ DNA từ 50-500 ng DNA thực vật).
Nước: thêm vào để thể tích cuối cùng là 50 μl.
Thể tích của mỗi ống phải là 50 μl.
Nếu mẫu DNA là plasmid chỉ khoảng 1 ng là đủ để chạy mẫu dương tính. Bước 3: Trộn nhẹ đều.
Bước 4: Nhỏ 1 giọt dầu lên bề mặt dung dịch.
Bước 5: Đặt ống PCR. Cho chạy máy theo chương trình đặt sẵn trong máy.
Bước 6: Sau khi phản ứng xong, hút bỏ lớp dầu khỏi ống nghiệm, dùng dung dịch phía dưới để chạy điện di trên gel agarose với điện thế khoảng từ 65-80 volt trong khoảng 1 giờ 30 đến 2 giờ. Xem kết quả trên máy chiếu UV.