Phương pháp Southern blot

Từ sự phát hiện chuỗi DNA có tính chất tương đồng với probe, phương pháp Southern blot (Southern, 1975) là một đóng góp rất to lớn trong sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật “recombinant DNA”, và xét nghiệm sự thể hiện gen được chuyển nạp, giúp ta hiểu rõ về cấu trúc gen, sự thể hiện gen, và tổ chức bộ gen (Meinkoth và

Wahl 1984). Ngoài ra, Southern blot còn giúp chúng ta chuẩn đoán các bệnh di truyền và phát hiện các pathogen là vi trùng hoặc virus (Karcher 1996).

Sau quá trình lai DNA, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng. Cuối cùng người ta sử dụng kĩ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị các phân tử lai. Trong kĩ thuật này, người ta đặt một film nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai. Các phân tử lai (đúng hơn là mẫu dò có đánh dấu phóng xạ) sẽ tác động lên film và kết quả được thể hiện qua các chấm đen trên film[3,4].

Phương pháp bao gồm các bước sau

Bước 1: DNA bộ gen được cắt thành

những đoạn kích thước khác nhau bởi một hay nhiều enzyme giới hạn (RE), các đoạn này được phân tách dựa vào kích thước qua điện di trên gel agarose.

Bước 2: DNA được làm biến tính (thành

hai mạch đơn) ngay trên gel rồi được chuyển lên một màng lai. Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn được giữ nguyên.

Bước 3: DNA cố định trên màng lai được

đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ.[3,5]

1.2. Giới thiệu về cây hoa cẩm chướng 1.2.1. Khái quát về cây cẩm chướng

Hình 1.13: Hoa cẩm chướng. (nguồn: hppt://www.wikimedia.com/) Một số loài cẩm chướng  Dianthus alpinus  Dianthus amurensis  Dianthus anatolicus  Dianthus arenarius  Dianthus armeria – Cẩm chướng Deptford  Dianthus barbatus – Cẩm chướng thơm lùn  Dianthus biflorus  Dianthus brevicaulis  Dianthus callizonus  Dianthus campestris  Dianthus capitatus  Dianthus carthusianorum – Cẩm chướng Carthusia  Dianthus caryophyllus L.- Cẩm chướng thơm  Dianthus chinensis - Cẩm chướng gấm  Dianthus cruentus  Dianthus deltoides – Cẩm chướng trinh nữ  Dianthus erinaceus  Dianthus freynii  Dianthus fruticosus  Dianthus furcatus  Dianthus gallicus – Cẩm

chướng Pháp hay cẩm chướng Jersey  Dianthus giganteus Giới: Plantae Bộ: Caryophyllales Họ: Caryophyllaceae Chi: Dianthus

 Dianthus glacialis  Dianthus gracilis  Dianthus graniticus  Dianthus gratianopolitanus – Cẩm chướng Cheddar  Dianthus haematocalyx  Dianthus knappii  Dianthus lusitanus  Dianthus microlepsis  Dianthus monspessulanus  Dianthus myrtinervius  Dianthus nardiformis  Dianthus nitidus  Dianthus pavonius  Dianthus petraeus  Dianthus pinifolius  Dianthus plumarius – Cẩm

chướng dại, cẩm chướng cỏ

 Dianthus pungens

 Dianthus repens – Cẩm chướng

Bắc cực  Dianthus scardicus  Dianthus seguieri  Dianthus simulans  Dianthus spiculifolius  Dianthus squarrosus  Dianthus subacaulis  Dianthus superbus – Cẩm chướng lớn  Dianthus zonatu  Dianthus sylvestris

Chi cẩm chướng (danh pháp khoa học: Dianthus) là một chi của khoảng 300 loài trong thực vật có hoa của họ Cẩm chướng (Caryophyllaceae), có nguồn gốc chủ

yếu ở châu Âu và châu Á, với một vài loài được tìm thấy ở miền bắc châu Phi, và

một loài (D. repens) ở khu vực ven Bắc cực của Bắc Mỹ. Tên gọi chung trong tiếng Việt của các loài này là cẩm chướng. Tên gọi khoa học Dianthus có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp dios ("thần, thánh") và anthos ("hoa"), và nó được nhà thực vật học Hy

Lạp Theophrastus (khoảng 370 TCN - 285 TCN) đặt ra.

Các loài trong chi này chủ yếu là cây thân thảo sống lâu năm, một số ít là một năm hay hai năm, và một số là các cây bụi thấp với thân dạng gỗ. Lá đơn, mọc đối, màu lục-xám hay lục-lam. Hoa có 5 cánh hoa, thường với mép nhăn, và gần như ở

mọi loài thì có màu từ hồng nhạt tới sẫm. Một loài (D. knappii) có hoa màu vàng với

phần ở giữa màu tím tía.[2, 18, 19, 22]

1.2.1.1 Lịch sử phát triển

Cẩm chướng có tên khoa học Diantus thuộc họ thanh trúc (Caryophyllaceae)

có nguồn gốc từ Châu Âu. Sở dĩ có tên cẩm chướng là vì cây cho nhiều hoa, hoa màu sắc đẹp, giống một bức trướng bằng gấm với nhiều màu trắng, đỏ hồng, tím... nhiều giống trên cùng một cánh hoa cũng có tới 2 - 3 màu. Có giống hoa đơn, hoa kép, nhiều dáng vẻ, mọc ở đầu cành. Các cành thanh mảnh, có đốt mang lá hẹp. Cây mọc thành một bụi. Hoa dùng cắm lọ nhỏ, cắm bàn chông hay cắm bát.

Năm 1970, lần đầu tiên các nhà làm vườn Pháp đã tạo ra giống cẩm chướng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều lần trong năm. Năm 1846, nuôi trồng được nhiều giống cẩm chướng hoang dại và điều khiển chúng ra hoa quanh năm. Năm 1852, cẩm chướng từ Châu Âu du nhập vào Mỹ. Tại đây đã có nhiều nghiên cứu về cây cẩm chướng. Họ đã gây đột biến và lai tạo để tạo ra nhiều giống mới như North, Berwick, Maine và William Sim.. với nhiều hình dáng và màu sắc hoa phong phú.

Cây cẩm chướng du nhập vào Việt Nam từ thập niên 60, chủ yếu được trồng làm cây cảnh, trang trí. Về sau, đến những năm 80 các giống cây cẩm chướng từ các nước Pháp, Hà Lan, Trung Quốc… du nhập vào nước ta. Hiện nay, cây hoa cẩm chướng không chỉ được trồng để trang trí mà được sản xuất để phục vụ mục đích kinh tế, sản xuất hoa cắt cành.

1.2.1.2 Tình hình sản xuất hiện nay

 Trên thế giới

Hoa cẩm chướng với màu sắc đa dạng, hình dáng phong phú, nhiều chủng loài, mùi hương hấp dẫn, tạo cảm giác vui tươi, khỏe khoắn cho mọi người đang ngày càng được ưa thích. Với những ưu điểm trên, cẩm chướng đã trở thành một trong bốn loài hoa cắt cành phổ biến trên thế giới, chiếm 17% sản lượng hoa cắt cành. Itali là nước có diện tích trồng cẩm chướng lớn nhât trên thế giới với sản lượng 2500 triệu cành vào năm 1995, Hà Lan đúng thứ hai với sản lượng 1800 triệu cành, Ba Lan đứng thứ ba với sản lượng 400 triệu cành… Colombia được xem là thiên

đường của hoa cẩm chướng với chất lượng hoa tốt nhất thế giới. Các nước khác như Israel, Trung Quốc cũng sản xuất hoa cẩm chướng với số lượng đáng kể.

 Trong nước

Trước đây hoa cẩm chướng được trồng làm cảnh trang trí. Từ năm 1975 đã có sản xuất hoa cắt cành với những giống nhập trước 1975. Từ năm 1995 có nhiều giống hoa cẩm chướng được nhập nội có nguồn gốc từ Hà lan, Trung quốc với màu sắc đa dạng phong phú.

Hiện ở nước ta đã tiến hành trồng được 3 loài Dianthus làm hoa cảnh tại Đà

Lạt là D. barbatus L., D.sinensis L. và D.caryophyllus L.. Cây hoa cẩm chướng phát

triển ở vùng có độ cao khác nhau tuy nhiên chất lượng hoa khác nhau. Vùng Vạn thành – phường 5, Thái Phiên Phường 12, Phường 7, 8 là những nơi trồng nhiều hoa cẩm chướng tại Đà Lạt. Vì vậy nên phổ biến cho người trồng hoa biết thêm những đặc điểm về các loài hay giống cẩm chướng này để trồng cho phù hợp.

Tại nước ta cẩm chướng có khoảng trên 20 giống được trồng trọt với mục đích cắt cành. Các giống trồng trọt hiện nay được chia theo nhóm sau:

 Nhóm hoa chùm: Màu đỏ, hồng, trắng, kem...Hoa nhỏ, cành thấp 30-40cm, mắt nhặt. Thời gian sinh trưởng 18-24 tháng.

 Nhóm hoa đơn: Màu đỏ, hoa lớn, cánh cao 70-80 cm, mắt thưa, ít chồi, thời gian sinh trưởng 15-18 tháng.

 Màu hồng, vàng, trắng, cam, kem, Vàng viền đỏ, hồng viền tím, đỏ viền trắng, hồng viền trắng... Hoa lớn, cành cao 65-75 cm, mắt thưa, nhiều chồi, thời gian sinh trưởng 18-24 tháng.

Hoa cẩm chướng có diện tích canh tác không lớn, chủ yếu trồng trong nhà có mái che plastic. Hàng năm Đà lạt cung cấp khoảng 0,3-0,5 triệu cành hoa cẩm chướng các loại. Hiện nay, Việt Nam đã xuất khẩu được các sản phẩm hoa cắt cành như hồng, phong lan, cúc, đồng tiền, cẩm chướng, ly ly, sao tím...sang Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Nhật bản, Singapore. Australia, Ảrập; vạn niên thanh, mai chiếu thủy, mai cảnh... sang Trung Quốc, Hoa Kỳ, Nhật Bản. Trong các loại hoa cắt

cành phổ biến xuất khẩu của Việt Nam thì hoa cẩm chướng đặc biệt đem lại nhiều lợi nhuận.[20, 23, 29]

Bảng 1.1: Tham khảo thị trường xuất khẩu hoa cây cảnh tháng 04/2007 Thị trường xuất khẩu Chủng loại Kim ngạch xuất khẩu (USD)

Nhật bản

Cúc, cẩm chướng,

hồng, kỳ lân 404.843,58

Australia Cẩm chướng, hồng 118.641,2

Bỉ Hoa tươi 11.865,7

Đài loan Cẩm chướng, kỳ lân 3.202,4

Thái lan Hoa tươi 3.074

Singapore Hồng 2.171,9

Inđônêxia Cẩm chướng, hồng, lys 1.035

Bảng 1.2: Tham khảo mặt hàng hoa cây cảnh xuất khẩu trong 10 ngày cuối tháng 07/2007

Chủng loại Kim ngạch tháng 07 Kim ngạch tháng 06 Chênh lệch

Cúc 183.724,47 95.641,9 88.082,57 Cẩm chướng 87.397,6 85.045 2.352,6 Hồng 27.305,2 27.393 -87,8 Lan 13.258 0 13.258 Hoa 5.645,4 5.500,9 144,5 Kỳ lân 585 474 111 Lys 76,2 0 76,2

1.2.2. Đặc điểm hình thái và sự sinh trưởng phát triển của cây cẩm chướng chướng

1.2.2.1 Đặc điểm hình thái

Hoa có nguồn gốc từ Địa Trung Hải và chuyển vào Việt Nam từ nửa đầu thế kỷ 20. Hoa trồng trong bồn, trong công viên, thông thường là sản xuất hoa cắt cành và thích hợp ở nhiều vùng sinh thái khác nhau.

Hoa cẩm chướng thơm thuộc họ Caryophyllaceae, đặc điểm thân mảnh, có các đốt ngắn mang lá kép, bé, thân gãy khúc nhiều, thân bò là chính, trên mặt lá có ít phấn trắng, hoa nhiều màu sắc, hoa đơn nhiều hơn hoa kép, lông nhỏ, ít bị sâu bệnh. Thân phân nhánh nhiều, có đốt dễ gãy giòn, lá cẩm chướng mọc đối phiến lá nhỏ dày, dài, không có răng cưa, mặt lá thường nhẵn.

Hoa mọc đơn từng chiếc một ở nách lá hoa kép có nhiều màu sắc ngay trên cùng một bông, quả mang nhiều hạt, có từ 330 – 550 hạt.

1.2.2.2 Sinh trưởng và phát triển

Các giai đoạn sinh trưởng của cẩm chướng bao gồm sự sinh trưởng của rễ, sự sinh trưởng của cành lá, sự sinh trưởng của hoa.

Sự sinh trưởng của rễ, rễ của cẩm chướng là rễ chùm, có rất nhiều nhánh rễ con, phân bố tập trung ở tầng đất mặt 20 cm, một số ít ăn sâu tới 40 – 50 cm. Ở trạng thái bình thường, rễ và tán cây phát triển theo tỷ lệ tương đương. Nếu đất nhiều phân, nhiều nước, rễ phát triển không tốt. Nhiệt độ cao cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của rễ.

Sự sinh trưởng của cành lá, sau khi ra được 10 – 20 đôi lá, trên đỉnh ngọn xuất hiện nụ hoa. Mỗi nách trên than chính thường có một mầm to, dài và một mầm nhỏ, ngắn (riêng cẩm chướng nhiều màu thì hai mầm nách dài như nhau). Những mầm nách phía trên thường có nụ hoa ra sớm và phát triển thành cành hoa. Những mầm nách phía dưới ra nụ sau và trở thành những mầm dinh dưỡng. Tốc độ sinh trưởng của lá phụ thuộc vào thời tiết: mùa xuân, mùa hè thường 4 – 5 ngày, mùa thu, mùa

đông từ 7 – 10 ngày ra một đôi lá. Trong 8 đôi lá đầu sát gốc có mầm nách ở trạng thái dinh dưỡng. Từ lá 15 – 18, mầm nách có thể phát triển thành nụ hoa.

Sự phân hóa hoa có thể chia thành 6 giai đoạn như sau. Giai đoạn 1 (chưa phân hóa): thời kì sinh dưỡng dinh dưỡng, đỉnh sinh trưởng có hình bán cầu, xung quanh có một đôi lá mầm đối xứng. Giai đoạn 2 (thời kì phân hóa hoa): là thời kì đỉnh sinh trưởng phình to, hình bán cầu trở thành bằng, dẹt. Giai đoạn 3 (hình thành đài hoa): đoạn trước đỉnh sinh trưởng có 5 vạch, đài hoa bắt đầu vươn dài, đỉnh sinh trưởng dày lên. Giai đoạn 4 (hình thành cánh hoa): đỉnh sinh trưởng to lên, các cánh hoa nằm ở nách đài từ từ nhô lên, lúc đầu tròn to, sau đó mọc ngang ra và mỏng, giữa hình thành tử phòng. Giai đoạn 5 (hình thành nhị đực, nhị cái): trong quá trình hình thành cánh hoa, tử phòng lớn dần lên, có thể hình thành nhị đực và nhị cái nhưng rất khó phân biệt, số cánh hoa lúc này đã định hình. Cuối cùng là giai đoạn 6 (hình thành phôi và phấn hoa): trong tử phòng hình thành phôi nhũ, trong túi phần hình thành rất nhiều hạt phấn, vòi nhụy có từ 2 – 4 khía.

Trong điều kiện thích hợp, sự phân hóa trên hình thành khoảng 30 ngày. Sau đó đài và cánh hoa tiếp tục sinh trưởng. Khi đài hoa ngừng sinh trưởng, cánh hoa vẫn tiếp tục dài ra cho đến khi hoa nở hoàn toàn.

1.2.3. Điều kiện ngoại cảnh

Môi trường trồng cẩm chướng bao gồm nhiều yếu tố, trong đó ánh sang, nhiệt độ, nước, không khí, dinh dưỡng và đất là những yếu tố quan trọng nhất. Các yếu tố này tác động tương hỗ với nhau đến sự sinh trưởng và phát dục của cẩm chướng.

 Ánh sáng: Cẩm chướng là loại cây ưa sáng, thích hợp với thời gian chiếu sáng dài. Thời gian chiếu sáng trong ngày càng dài, cây càng nhanh phân hóa, càng nở đều. Lượng chất khô và tốc độ sinh trưởng của cây tương quan với cường độ chiếu sáng mạnh, làm hoa dễ bị nhạt màu và cháy, ảnh hưởng đến chất lượng hoa. Các thí nghiệm cho thấy chiếu sáng bổ sung giúp kích thích đốt dài, ức chế cành nách, tăng đường kính hoa, giúp hoa có màu tươi hơn.

 Nhiệt độ: Cẩm chướng là loại cây ưa khí hậu mát mẻ. Nhiệt độ thích hợp cho cây cẩm chướng là 18 – 200C, trong phạm vi từ 10 – 150C, cây vẫn sinh

trưởng bình thường và cho kết quả tương đối tốt. Nhiệt độ quá 300C, cây sinh trưởng kém, thân, lá, hoa đều nhỏ, sản lượng và chất lượng thấp. Dưới 100C, cây sinh trưởng yếu, sản lượng giảm rõ rệt. Nhiệt độ chênh lệch giữa ngày và đêm tốt nhất là 100C, nếu không chất lượng hoa kém, số lượng hoa mù cao.  Nước: Hàm lượng nước trong hoa cẩm chướng chiếm khoảng 70 – 80%, trong

cành 68 – 70%, trong rễ là 80%. Nước có vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát triển của cây cẩm chướng. Nước là nguyên liệu quang hợp, cây thiếu nước, quang hợp giảm. Ngoài ra, nước là dung môi của nhiều chất dinh dưỡng, là môi trường thực hiện các phản ứng sinh hóa. Nước điều tiết nhiệt độ cây, đa số nước trong cây thoát ra ngoài qua lá, khi thoát hơi nước sẽ làm giảm nhiệt độ trong cây, nên nước điều khiển lượng nhiệt trong cây khi trời nắng nóng. Sự lưu thông nước càng nhiều thì hoạt động sinh lý càng mạnh.  Không khí: Cẩm chướng ưa khí hậu mát mẻ, thông thoáng. Trồng ở nơi kém

gió, nhiệt độ cao, cây dễ mắc bệnh. Cần tăng độ thoáng khí để cây sinh trưởng và phát triển tốt. Kết quả nghiên cứu cho thấy: bổ sung CO2 cây sinh trưởng nhanh, tăng chất lượng hoa nhưng không tăng được sản lượng và tuổi thọ hoa.  Đất đai: Khoảng 70% số rễ của cẩm chướng tập trung ở tầng đất mặt (từ 0 - 20cm). Vì vậy cải thiện kết cấu vật lý ở tầng đất này (bằng cách trộn thêm than bùn, một số chất tơi xốp để tăng độ rỗng cho đất đạt từ 3 – 5%...) sẽ tạo điểu kiện cho rễ cẩm chướng phát triển tốt hơn. pH thích hợp từ 6 – 6.5. Cần đảm bảo đủ độ ẩm, thông thoáng, tơi xốp. Chú ý khử trùng và tiêu độc cho đất trước khi trồng nhiều vụ cẩm chướng. Cây hoa cẩm chướng ưa đất thịt nhẹ, tơi, xốp, nhiều mùn và dinh dưỡng, thoáng khí và giữ ẩm tốt.

 Chất dinh dưỡng: Trạng thái dinh dưỡng của cây thường biểu thị bằng % nguyên tố dinh dưỡng và độ chất khô trong lá. Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ dinh dưỡng lý tưởng nhất là: đạm 3 – 3.5%, lân 0.2 – 0.3%, kali 3 – 4%, canxi 1 – 2%, magie 0.2 – 0.5%. Để đạt năng suất cao, chất lượng tốt cần đảm bảo thành phần và hàm lượng dinh dưỡng trong đất ở mức độ thích hợp nhất: đạm 100mg/l, lân 20mg/l, kali 30mg/l, canxi 150 – 200mg/l. Lưu ý, với điều kiện trồng khác nhau thì khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng khác nhau.

1.2.4. Nhân giống cây cẩm chướng

Cây cẩm chướng được nhân giống bằng phương pháp hữu tính hoặc vô tính.

1.2.4.1 Nhân giống hữu tính

Chọn những cây khỏe, có hoa đẹp, không sâu bệnh, màu hoa tươi, sặc sỡ, hoa to. Cây để lấy hạt làm giống không nên cắt hoa, chỉ để giống ở cây chính vụ. Hạt hoa